检测细胞内钙动员的几种红色荧光钙离子指示剂的比较
今天，我们比较了使用四种红色荧光钙指示剂Calbryte 590 AM，Rhod-2 AM，Rhod-3 AM和Rhod-4 AM在细胞内的钙相应检测结果。 我们使用FlexStation3多模式酶标仪在染料染色的细胞上使用不同剂量的ATP测量动力学响应。与Rhod-3不同，Calbryte 590 AM所需的清洗次数更少，并且可以在不用丙磺舒作为有机阴离子转运蛋白抑制剂的情况下使用。更长的保留时间和最小的渗漏属性，使Calbryte 590可用于活细胞中细胞内Ca2+水平的中/高通量分析。
材料和方法
- 96孔板（黑色透明底，Greiner Bio-one）
- FlexStation3（分子设备）
- Calbryte 590 AM（AAT Bioquest，#20702）
- Rhod-4 AM（AAT Bioquest，#21120）
- Rhod-3 AM（ThermoFisher，#R10145）
- Rhod-2 AM（AAT Bioquest，#21060）
- PLURONIC ® F-127（AAT Bioquest，#20053）
- 丙磺舒（#20061）
- 荧光显微镜（Keyence）
细胞培养
将仓鼠卵巢-CHO-K1细胞在黑色96孔板中于含10％FBS和青霉素-链霉素混合物的Ham's F-12培养基中培养过夜。
钙染料负载和细胞刺激
细胞加载用5μM钙染料（Calbryte-590 AM，RHOD-2 AM，RHOD-3 AM或RHOD-4 AM）在培养基中的Pluronic ® F-127（PF-127）和丙磺舒（PBC）在37°C的恒温箱中培养60分钟。洗去染料加载溶液，并将200 µLHanks和20 mM Hepes缓冲液（HH缓冲液）PBC加入板中，并在室温下孵育30分钟。将各种剂量的ATP溶液（5X工作溶液）添加到FlexStation3加载室中，并以50 µL的浓度添加到所需的孔中，以达到指示的最终浓度（0-10 µM，3X系列稀释液）。在装有PBC的HH缓冲液中的未加载细胞的孔中获得背景荧光。
仪器设定
| 荧光强度，Flex模式 | |
| 仪器 | FlexStation 3（分子设备） |
| 光学设置 | Ex / Em = 540/590 nm截止= 570 nm |
| PMT灵敏度 | 介质 |
| 读取模式 | 底读模式 |
| 运行 | 200秒 |
| 间隔 | 10秒 |
| 读取次数 | 21读 |
| 添加率 | 4 µL /秒 |
| 时间点 | 16秒 |
结果与讨论
为了研究哪种红色Ca2+染料在96孔板测定中表现最佳，将CHO-K1细胞加载了Calbryte 590 AM，Rhod-2 AM，Rhod-3 AM和Rhod-4 AM并用ATP处理刺激P2Y信号，并监测Ca2+水平的细胞内变化。如图1A所示，Calbryte 590在ATP刺激下表现出最高的信号/背景比，其次是Rhod-4 ，Rhod-3和Rhod-2。
向该测定中添加丙磺舒的目的是通过抑制有机阴离子转运蛋白来使染料泄漏最小化。我们在没有丙磺舒的情况下进行了整个测定，并观察到Calbryte 590在不牺牲信号/背景比的情况下表现最佳。（图1和图2）。
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| 图1.在存在丙磺舒（左）和不存在丙磺舒（右）的情况下进行Ca2+检测测定，并使用Ex / Em = 540/590的FlexStation3测量了570 nm的截止波长。 | |
图2.荧光成像：在没有丙磺舒的情况下进行Ca2+检测测定，并使用TRITC滤光片组使用荧光显微镜测量响应。
总结
在96孔板中研究CHO-K1细胞中P2Y1介导的Ca2+信号传导方面，Carbyte 590和Rhod-4 AM比Rhod-3 AM更好。高性能可用于高通量分析活细胞中细胞内Ca2+的水平测定。
