片段化处理mRNA纯化手法的思路

mRNA纯化之后的文库构建通常有两种思路，一种是先用oligo（dT）引物反转录mRNA，再进行cDNA的片段化，另外一种则是先将mRNA打断，再结合随机引物进行反转录。
 

1.先用oligo（dT）引物反转录mRNA，再进行cDNA的片段化：此方法先得到长片段的cDNA，反转成双链cDNA之后再利用DNA片段化的方法进行片段化（酶切法或机械法），得到片段化dsDNA之后的建库方法与DNA建库方法完全一致。
 

2.先将mRNA打断，再结合随机引物进行反转录：此方法中的mRNA打断方法包括碱处理法、金属离子（Mg2+、Zn2+）溶液处理法、酶（RNaseIII）处理法，mRNA片段化之后应立即进行一链cDNA合成，因为mRNA在该体系下非常容易降解。选择金属离子（Mg2+、Zn2+）溶液处理法打断时需根据需要的文库片段大小选择合适的打断温度和时间。（一般设置为150-200bp 94°C，15 min； 200-300bp 94°C，10 min； 250-550 bp 94°C，5 min）

先针对mRNA进行打断再进行反转录获得测序reads主要是针对基因本体的；若先反转录，尤其是结合oligo(dT)进行反转录获得的测reads对转录本3'端具有比较强的偏好性，所以在mRNA-Seq中建议采用先对mRNA打断再进行反转录的文库构建方法。