植物磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPCase)测定试剂盒说明书
产品组成：植物磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPCase)测定试剂盒
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组分货号 |
名称 |
规格 |
贮存 |
运输 |
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RTU4062-01 |
试剂1-PEPCase提取缓冲液（2×） |
100 ml |
短期4℃，长期-20℃ |
常温 |
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RTU4062-02 |
试剂2-PEPCase Assay buffer(10×) |
15 ml |
短期4℃，长期-20℃ |
常温 |
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RTU4062-03 |
试剂3-PEP（100×） |
1 ml |
-20℃ |
常温 |
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RTU4062-04 |
试剂4-NADH（100×） |
1.2 ml |
-20℃ |
常温 |
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RTU4062-05 |
试剂5-MDH（100×） |
2 KU |
-20℃ |
常温 |
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RTU4062-06 |
试剂6-酶溶解缓冲液 |
5 ml |
-20℃ |
常温 |
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BSA-02 |
试剂7-BSA溶液 50mg/ml |
5 ml |
-20℃ |
常温 |
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DT0140P |
试剂8-1MDTT（100×） |
1 ml |
-20℃ |
常温 |
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DE005 |
试剂9-灭菌水 |
100 ml |
4℃ |
常温 |
● 产品简介：
磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 (Phosphoenolpyruvate carboxylase, PEPCase)是 C4 植物和CAM 植物固定CO2的关键酶，催化磷酸烯醇式丙酮酸与二氧化碳反应生成草酰乙酸，在植物和细菌中广泛存在，在动物及丝状霉菌中缺乏此酶。此酶是变构酶，主要功能为三羧酸循环提供草酰乙酸， 另外也与 C4 植物光合二氧化碳固定反应及景天科植物的苹果酸形成 (景天酸代谢 )等有关。
磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 (PEPCase)检测试剂盒检测原理如下：在弱碱条件下，PEPCase 催化 磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)和CO2形成草酰乙酸(OAA)；OAA 在苹果酸脱氢酶(MDH)催化下被 NADH 还原为苹果酸 (Mal) 。在碱性条件下每吸收 1 分子 CO2伴随 1 分子 NADH 氧化，通过分光光度计测定处吸光度的变化，计算出 NADH 的消耗速率，进一步推算出磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性水平。
该试剂盒主要用于检测植物样本中磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性。该试剂盒仅用于科研领域，不宜用于临床诊断或其他用途。
按照一次使用1 ml 提取缓冲液计算，试剂盒可以使用100次。
● 自备材料：
植物材料；剪刀；液氮；研钵或其他研磨设备；1ml石英比色皿；紫外分光光度计；制冰机；低温离心机
● 操作步骤：
一、 即用型PEPCase提取缓冲液配制：
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一个反应配制体积 |
n个反应配制体积 |
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1 ml |
n×1 ml |
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PEPCase提取缓冲液（2×） |
500 μl |
n×500μl |
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灭菌水 |
470 μl |
n×470 μl |
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1 M DTT（100×） |
10 μl |
n×10 μl |
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BSA溶液50mg/ml |
20 μl |
n×20μl |
注：1. 即用型PEPCase提取缓冲液尽量现配现用，短期4℃中可以过夜保存。
二、 PEPCase样品提取：
1. 取新鲜植物组织，清洗干净，擦干，液氮中研磨，1 cm2叶片（1分硬币大小）或0.1g叶片粉末加入1 ml 即用型PEPCase提取缓冲液，颠倒混匀，冰浴放置5-10分钟。
2.12000g4℃离心 5分钟，上清即为PEPCase提取液，冰浴放置备用。
注：提取液最好立即测定，不建议保存。
三、PEPCase活性测定分析：
1. 即用型酶溶解缓冲液配制：
按照标签所示，在试剂6-酶溶解缓冲液原瓶中加入1.5 ml灭菌水和1 ml BSA溶液（50mg/ml），混匀后即配成即用型酶溶解缓冲液，冰浴备用，-20℃保存。
2. 试剂3-PEP：按照标签所示加入灭菌水，彻底混匀后冰浴备用。
3. 试剂4-NADH：按照标签所示加入灭菌水，彻底混匀后冰浴备用。
注：NADH稳定性较差，用后-20℃贮存3-4天，长期-80℃保存。
4. 试剂5-MDH：按照标签所示加入即用型酶溶解缓冲液，彻底混匀后冰浴备用。
5. 反应体系设定：
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加入顺序 |
组份 |
1ml反应体系加入量 （测定1个样品） |
MasterMix配制 （测定n个样品为例） |
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1 |
10×PEPCase Assay Buffer |
100 μl |
n×100 μl |
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2 |
灭菌水 |
870 μl |
n×870 μl |
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3 |
NADH溶液（100×） |
10 μl |
n×10μl |
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4 |
PEP溶液（100×） |
10 μl |
n×10 μl |
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5 |
MDH溶液（100×） |
10 μl |
n×10 μl |
5. 反应体系测定；
1.5 ml离心管中配制以下反应
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1 |
2 |
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对照反应 |
样品活性测定 |
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MasterMix |
975 μl |
975 μl |
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即用型PEPCase提取缓冲液（步骤一） |
25 μl |
- |
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PEPCase样品提取液 （步骤二） |
- |
25μl |
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混匀后加入到1 ml比色皿中，立即计时，此时吸光度为A0，每隔 10s 测定一次吸光度，其中至 1min 时处吸光度记为A1，记录其变化。 |
注意： = 1 \* GB3 ① 一般分光光度计OD340读数在0.5-3之间数据比较准确，低于此范围说明提取用的材料太少，酶活性太低；高于此范围说明所用材料太多，酶活性太高，此时可以将PEPCase样品提取液用即用型PEPCase提取缓冲液稀释后测定。
= 2 \* GB3 ② 该反应系统是利用速率变化，求得相应 OD 的变化，进而推算出 NADH 的消耗速率，再进一步推算出磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的量。 因此加入PEPCase样品提取液后立即计时很重要，每次检测指标不宜过多，否则有可能由于操作时间有差异进而导致结果偏差。
四、PEPCase活性计算：
根据如下公式计算样品中PEPCase活性：
1. 根据叶片面积的计算公式：
Activity（μmol·m-2·S-1）=
=
Activity（μmol·m-2·S-1）-表示每秒每平方米叶片有多少μmol NADH被氧化
△A-反应最初1分钟内340nm处测定管吸光度变化的绝对值，△A=A0-A1
N-稀释倍数，本程序中为40（1 ml提取液，取25μl测定）。
6.22-每微摩尔NADH在340nm处的吸光系数
d-cm 比色皿光程，一般为1 △t-秒 测定时间，本程序为60秒 S-cm2 提取时使用的叶面积
2. 根据叶片鲜重的计算公式：
Activity（μmol·g-1·S-1）=
=
Activity（μmol·g-1·S-1）-表示每秒每克鲜重叶片有多少μmol NADH被氧化
△A-反应最初1分钟内340nm处测定管吸光度变化的绝对值，△A=A0-A1
N-稀释倍数，本程序中为40（1 ml提取液，取25μl测定）。
6.22-每微摩尔NADH在340nm处的吸光系数
d-cm 比色皿光程，一般为1
△t-秒 测定时间，本程序为60秒
g- 提取时使用的叶片鲜重
