无标记活细胞动态分析技术在神经生物学方面的应用

 

神经生物学是生物学中研究神经系统的解剖、生理和病理方面内容的一个分支。神经科学寻求解释神智活动的生物学机制，即细胞生物学和分子生物学机制。近年来神经干细胞逐渐成为神经生物学中的一大研究热点。神经干细胞是一群能自我修复和具有多种分化潜能的细胞，通过体外分离纯化得到的小鼠或人源神经干细胞，可以在特定条件下分化成为神经元、星形胶质和少突胶质等细胞，从而成为再生医学中极为理想的理论研究对象和临床应用来源。神经干细胞的这种特性为神经损伤和中枢神经退行性疾病的治疗提供了可能的途径，并为损伤或病变的中枢神经组织恢复相应的功能这些人类多年来一直未能解决的治疗难题提供了广阔的思路和诱人的前景。

 

目前对神经干细胞在增殖、分化和凋亡过程中的机制研究，主要通过显微镜成像、芯片表达谱、免疫组化和电生理学这些传统的“终点检测法”来完成数据的获取和分析，这种实验方法仅能在预先设定的有限时间点上采集数据，这样由于无法观察到整个实验进程的变化，研究者很容易忽视一些重要的生物学事件。因此，如果采用活细胞动态观察来完整地记录实验进程，不但避免了一些有意义的生物学事件的丢失，而且能了解到此事件是如何形成的（例如单个神经干细胞从开始分裂、增殖并随后分化直至最后凋亡的全过程），这种动态的完整记录对于科研工作者而言是非常直观和具有启发意义的。

 

此外，传统的“终点检测法”往往需要把细胞进行各种生物素标记或荧光染色，而这些标记可能对细胞的生物学活动有潜在的影响，因此检测的指标并不能真正反映细胞生理上的变化。如果有一种真正的无标记检测手段，使细胞在没有任何外界干预而自然生长的情况下，对各种细胞形态变化的参数进行分析，就能达到还原最真实的细胞行为变化的目的。CM Technologies公司的Cell-IQ无标记活细胞分析平台则为我们提供了这样一种新的可能。

 

●  神经干细胞的分化

●  神经元突触的测量

●  神经干细胞（或神经球）的增殖

●  神经元/神经元的迁移和运动能力的追踪

●  神经干细胞发育的谱系分析

 

 

Cell-IQ对于无标记细胞相差图像的分析原理就是基于其对细胞形态的识别。下图是一张神经干细胞经过三天分化后的相差图。这张图片中的所有细胞从形态上大概可以分为以下四种类型：图A的类神经胶质细胞；图B的类神经元细胞；图C的正处于增殖分裂的细胞；图D的一些细胞碎片。Cell-IQ的软件能对其中每种类型的典型细胞进行识别、挑选和分门别类，并根据这样一个分类细胞库，自动统计各类细胞的个数和比例，以生成一条随时间变化的动态曲线，以此研究在这段时间中，神经干细胞的分化情况。

 

 

 

 

Cell-IQ可以对所分化的神经元突触长度和细胞个数进行测量和计数，并对不同的处理组结果进行比较。相比于传统的需要将照片获取后，然后进行手工或者半自动的测量实验操作方式而言， Cell-IQ软件可以进行批量化处理，极大地提高分析效率，花费更少的时间和人力，而结果更加真实可靠。

 

左图是一个神经胶质瘤细胞（NG108-15）的分化实验，实验先用isoquercitrin（一种黄酮类化合物）处理NG108-15细胞后，再放入Cell-IQ中进行4天的分化诱导和图像采集。图中红点代表的是神经细胞，蓝线为软件所识别的分化后的神经元突触。实验结果表明，在培养基-1的条件下，NG108-15细胞的分化更为显著。

 

 

 

 

细胞追踪是细胞学和生物学研究中重要的组成部分之一，在细胞行为、药物和疾病中的研究至关重要，尤其对神经干细胞增殖和分化的变化以及细胞相互作用的调控机制研究具有重要的意义。目前对一个目标细胞或大量细胞进行全面和准确地追踪，同时尽量避免其他细胞的干扰，是细胞追踪的难点，也是近些年细胞追踪的研究热点。Cell-IQ强大的分析软件可以对每个细胞的活动轨迹进行自动或手动追踪和标记，然后绘制出中心轨迹图或者角度分析图，并能给出每个细胞的移动距离、位移、速度和方向等参数。

 

下图为一个小鼠胚胎脑皮层来源的神经干细胞的运动追踪分析实验。采集到图像后，Cell-IQ软件可以对视野中的每个细胞或者所有细胞进行追踪，并得到每个细胞最终的运动轨迹和方向图，其余的如运动距离和速度等参数都能以Excel格式保存，方便随时调用或用第三方软件分析。

 

 

 

 

 

 

神经干细胞可以通过对称分裂的方式进行增殖，或通过不对称的分裂方式产生神经组织的其他各类细胞。其中，干细胞的谱系分析是研究神经干细胞发育和分化机制的重要工具和手段。通过建立细胞谱系标记技术来追踪神经干神经的分裂和分化，从而得到细胞的谱系图，在神经干细胞分化调控机制的研究中具有重要意义。

 

下图为小鼠胚胎脑皮层来源的神经干细胞的分裂谱系分析实验。分析时，我们选取了视野中的三个细胞进行增殖和分裂的追踪，并详细记录了一个细胞如何从单个细胞分裂成两个再到四个，最后停止增殖分裂的全过程。最后，Cell-IQ软件能根据追踪的结果，自动得到每个细胞增殖分裂的谱系图。

 

 

 

 

3D细胞培养旨在建立最贴近生理条件下的实验系统，从而更好地模拟细胞在体内的生长环境。然而3D细胞样品如神经球成像一直以来是一个难题，许多传统的显微镜无法同时对多个平面进行聚焦从而保持整个球体细胞的图像清晰。Cell-IQ的多层Z-stack扫描成像技术配合智能追焦功能，可以跟踪细胞样品在Z轴的高度变化而自动调整最佳的聚焦平面，从而确保活细胞在长时间的生长、运动过程中总处于聚焦范围内，因此可以对3D细胞样品如神经球和胚胎等进行成像和分析。

 

 

上图为球体细胞（spheroid）的增殖实验，在加入抑制剂后，球体细胞向外迁移和增殖的能力得到了显著的抑制。Cell-IQ的软件能够分别对绿色的球体本体和红色的迁移细胞进行面积的计算，从而实时动态地定量给药前后球体细胞向外迁移增殖的情况。

 

 

上图为悬浮培养的神经球增殖实验。通过降低载物台的移动速度和加速度，减少震动对体系的影响，悬浮细胞同样能进行成像和分析。实验结果表明，给药处理后显著抑制了神经球的增殖。

 

除了在相差图片上的无标记分析外，Cell-IQ还提供了3种荧光通道，多达30多种荧光滤片的选择，可以满足绝大多数荧光染色的需求。因此，一方面我们可以对已经标记荧光的细胞同时进行相差图片和荧光图片的采集、合并和分析；或者在完成相差图片的采集后，再将细胞固定后进行传统的免疫荧光染色以进一步验证无标记的分析结果。

 

下图为神经干细胞的分化实验。图A为相差图片，图B为神经元marker βIII-tubulin的染色结果。在图A和B中，红色箭头所指的神经元突触表明相差图片和荧光染色的结果是相互匹配的。图C的白色短箭头代表的是类神经元细胞，同样在图D的染色中得到了证实（红色）；而图C的白色长箭头在形态上类似于胶质细胞，而这个结果也与图D胶质细胞的 marker vimentin染色（绿色）结果相一致。

 

 

 

结束语：以上是无标记活细胞动态分析技术在神经生物学方面的应用。其中不难看出，无标记分析技术的原理是基于在相差图片的基础上，通过对细胞形态的识别和分辨来对细胞行为变化的各种参数进行实时动态地定量分析。因此，无标记活细胞动态分析技术旨在杜绝一切外界因素（如生物素标记和荧光染色）干扰的情况下，尽可能地让细胞自然地生长从而还原细胞最天然的生理状态，通过在这种“原生态”的细胞上动态观察和实时定量细胞形态、行为的变化，力求记录一个最真实的生物学事情的发生和演变！

平台简介：Cell IQ是芬兰CM Technologies公司生产的一个集培养管理、观察记录和分析于一身的一体式无标记活细胞动态分析系统。其通过专利细胞封盖系统来实现精密的微小培养室体系，从而保证细胞在最优的生长环境下维持一个健康稳定的状态以进行长期的培养观察和记录。内置的成像系统和专业高灵敏的数码CCD相机，再配合独特的全聚焦和智能追焦技术，可确保活细胞在长时间的生长和运动过程中总处在聚焦范围内，以此获得高质量的细胞相差图片，因此可以对3D细胞样品如神经球和胚胎等进行成像和分析。最后，Cell-IQ强大且创新的的分析软件可在完全无标记的“原生态”细胞相差图像上，通过对其形态的分辨与识别来进行不同细胞种群、周期和时期的区分划类从而完成各种复杂的无标记实验。