在读板机上进行基于时间分辨荧光标记的Western Blot蛋白检测和定量-Molecular Devices SpectraMax I3 Western Blot

在读板机上进行基于时间分辨荧光标记的Western Blot蛋白检测和定量

Vanitha Thulasiraman1, Jia-Ren Lin2, Cathy Olsen1, Rainer Muehlbacher3, Brian Quast1,
Michael Katzlinger3, Josef Atzler3, Karlene A. Cimprich2, Evan F. Cromwell1                1Molecular Devices LLC, Sunnyvale, California, USA; 2Department of Chemical & Systems Biology,Stanford University, Stanford, California, USA; 3Molecular Devices GmbH, Salzburg, Austria

摘要

蛋白检测在制药和临床研究领域是一项非常重要的项目，而Western Blot(WB)检测则是众多蛋白检测方法中最常见的一种。目前，检测转印到WB膜上蛋白的技术众多，包括荧光标记、银染和化学发光法等。可是，每一种技术都有其局限，人们一直致力于寻找提高WBs定量准确度和动态检测范围的技术方法。这里，介绍一种最新的在SpectraMax i3或Paradigm多功能酶标仪上检测WBs膜的蛋白分析方法。膜上使用铕元素-螯合物或链霉素标
记二抗特异结合被研究的蛋白。铕元素标记具有长荧光寿命周期，可至1ms级别，所以荧光的检测采用时间分辨的模式，从而可以减少来自于自发荧光和其他短寿命周期的杂光的背景。WBs膜被置于酶标仪内，然后使用TRF卡盒进行WBs膜优化扫描。此方法不涉及酶的检测，加之铕元素-螯合物标记物具有很强的光漂白抗性，因而信号十分稳定能至几周到几个月，这就允许对膜进行重复扫描以及可能进行不同条带的强度对比以及根据标品进行更精确的定量。TRF检测方式采用单光子计数模式，所以理论的动态检测范围为>105。实际应用中，动态检测范围则受限于高含量条带的荧光饱和以及非特异性结合造成的背景因素。由于不使用CCD不会出现高光溢出现象，而这却是化学发光和普通荧光检测的常见问题，所以此方法能够提供非常锐利的条带和出色的图像质量。这一新颖的多功能酶标仪检测平台上的Sc a n l a t e r  Western Blot检测系统以其操作简便、检测灵敏和信号的超高稳
定性，提供了出色的WBs检测性能表现，必将给多功能酶标仪在实验室应用方面带来又一重大突破！

原理

ScanLater Western Blot检测系统简化了Western Blot的流程，二抗使用铕元素-螯合物标记物，扫描在酶标仪上进行。不需要底物，膜洗涤后直接进行扫描检测。铕元素具有长荧光寿命周期，至1ms，检测模式使用时间分辨模式(TRF)，可以极大减弱自发荧光和其余短寿命背景杂光。

Figure 1. 上左：蛋白检测示意图。二抗直接使用铕元素标记。上右：铕元素-螯合物激发和发射光谱。下右：TRF检测模式，铕元素的荧光周期与背景荧光的衰减周期对比，信号的检测采取一定时间延迟，从而去除背景荧光干扰。

材料与方法

材料
• Scanlater Western Blot试剂盒(10X Washing Buffer, 5X Blocking Buffer, Eu-Labeled Anti-Mouse IgG, Eu-Labeled Anti-Rabbit IgG, Eu-Labeled Streptavidin)，由Molecular Devices, LLC.提供。
• Western Blot膜使用SpectraMax Paradigm或SpectraMax i3 多功能读板机进行扫描(Molecular Devices)。
• 谷胱甘肽S-转移酶(GST), 生物素化兔抗GST, 鼠抗-GST, 兔抗转铁蛋白，转铁蛋白(Abcam)。化学发光底物和HRP-二抗(Millipore)。
• TGX 4-20% 胶，双标记蛋白标品，电泳缓冲液，上样缓冲液，转印缓冲液，蛋白转印系统(Bio-Rad Laboratories)， Immobilon FL膜(Millipore)。

方法
• 在200V电压下，蛋白于TGX 4-20%中，跑胶30min，之后使用Trans Blot Turbo电转印7min到PVDF膜上，然后使用TBST漂洗30s，再用1X封闭液封闭1h。
• 一抗以一定比稀释比例直接加到封闭液中，室温下放置2小时或4℃过夜，1X洗液洗膜三次，每次5min。
• 二抗按照1:5000使用1X封闭液进行稀释，然后加到膜上孵育60min，然后1X洗液洗膜三次，每次5min，最后在去离子水中漂洗15s，晾干准备进行扫描。
• 在SpectraMax Paradigm或 SpectraMax i3多功能读板机上进行扫描检测，使用SoftMax® Pro软件进行分析。

灵敏度和动态检测范围

使用GST进行灵敏度和动态检测范围测试，使用1X上样液三倍梯度稀释GST，然后加到4-20%梯度胶中跑胶30min，然后转印到Immobilon FL膜上，使用生物素标记的兔抗-GST标记2小时，之后与Eu-标记的链霉素孵育1小时，然后洗膜，晾干使用SpectraMax Paradigm多功能酶标仪进行扫描。系统表现出亚-皮克级的检测灵敏度和>4logs的动态检测范围。

Figure 2. 上图: SpectraMax Paradigm扫描的GST梯度稀释标品图像(注：伪彩标尺用来显示大的动态检测范围)；下图：为每个条带的总体荧光强度，统计显示整个动态检测范围为4logs，线性检测范围为3logs，图像分析使用Image J。

信号稳定性

铕元素-标记的一个最突出的优点之一是信号的稳定性以及对光漂白的抗性，以致western膜印记条带的稳定性可达数月之久。为了显示这一点，我们将三倍梯度稀释的转铁蛋白进行跑胶(4-20%梯度胶)30min，然后转印Immobilon FL膜上，4℃与兔抗-转铁蛋白过夜孵育，然后与铕元素-标记的抗兔IgG 4℃孵育1小时，然后洗膜，晾干，使用SpectraMax Paradigm分别于当天和一个月之后进行扫描。

• 信号经过30天也几乎没有损失
• 高度可定量结果

此外，条带可以进行多次重复扫描，信号也不会降低，将2倍梯度稀释的转铁蛋白跑胶(4-20%梯度胶)30min，然后转印Immobilon FL膜上，与兔抗-转铁蛋白孵育2小时，然后与铕元素-标记的抗兔IgG 4℃孵育1小时，然后洗膜，晾干，使用SpectraMax Paradigm进行多次扫描。

应用
• 使用Scanlater Western Blot技术检测痕量表达的内源性泛素化Rad-18蛋白(参与UV-损伤DNA修复过程)。

Figure 5. 使用不同浓度(0, 50, 100 ppm)的致癌物MMS(一种烷化剂)处理HEK293细胞，然后分别使用Scanlater TRF法和化学发光法进行检测和结果对比(Stanford University)。

• 使用ScanLater Western Blot技术检测痕量内源性的磷酸化的pChk1(参与UV & MMS-损伤DNA修复过程)。

Figure 6. 检测分别使用致癌物MMS和UV辐射处理的HEK-293细胞中磷酸化的pChk1(Stanford University)。

• 使用ScanLater Western Blot技术检测信号转导过程细胞刺激和抑制过程中产生的痕量内源性的磷酸化的JNK1蛋白；

Figure 7. 检测刺激和抑制后的自然人类肺成纤维细胞(NHFL)中的磷酸化的JNK1蛋白 (结果来自试用客户)。

总结
• 灵敏度：能够检测超低含量的人类细胞当中的内源性的磷酸化和泛素化的蛋白；
• 背景消除：铕元素时间分辨荧光标记，具有超长荧光寿命，至1ms级，使用TRF检测模式能够极大地降低自发荧光和其他来源的背景噪声；
• 节省时间：无需进行ECL般的耗时优化过程；
• 降低成本：不再需要成本高昂的X-射线胶片和显影剂；
• 即插即用：可随时在SpectraMax i3或SpectraMax Paradigm多功能酶标仪上进行高性能WB检测，极大地扩展了其在实验室研究方面的应用。