响应面法优化隐甲藻产DHA的培养基

响应面法优化隐甲藻产DHA的培养基

梅志刚^1[1]，王菊芳^2，*[2]

（华南理工大学  生物科学与工程学院  广东  广州  510006）

摘要：利用响应面法优化隐甲藻产DHA的培养基，在8种因素的单因素实验基础上，采用Plackett-Burman设计筛选出葡萄糖和胰蛋白粉为显著影响因子，维持其它组分浓度在低水平不变，对以上两因子爬坡逼近最大响应区域后利用中心组合设计和响应面分析得到最高点和主要因子的浓度。优化后的培养基组成为：葡萄糖30.54g/L, 胰蛋白粉5.03g/L，酵母粉4g/L，甘油20g/L，不添加MgCl₂和维生素溶液，其他组分同460培养基，在此培养基条件下，DHA产量达到907.54±1.02mg/L，是优化前产量的2.48倍。

关键字：隐甲藻，DHA，响应面

 

Response surface method for optimization of medium composition of Crypthecodinium.cohnii for DHA production

MEI Zhi-gang¹, WANG Ju-fang^2,*

Abstract: On the basis of single-factor experiments, eight factors were selected for response surface method for optimization of medium composition of Crypthecodinium cohnii. The results showed that glucose and tryptone were the significant factors by using Plackett-Burman design and other components were kept at the low concentration. Then the steepest ascent experiment was designed for the significant factors (glucose and tryptone) to reach the largest region, highest point and the concentrations of those significant factors were obtained by central composite experiments and response surface analysis. The optimized medium were as follows: glucose 30.54g/L, tryptone 5.03g/L,yeast 4g/L，glycerin 20g/L,without MgCl₂ and Vitamin solution, other components are the same with the 460 medium. After medium optimization, the DHA productivity was 907.54±1.02mg/L, as much as 2.48 times of that in primary medium.

Key words: crypthecodinium.cohnii; DHA; response surface

 

DHA(docosahexaenoic acid)是一种ω-3系列多不饱和脂肪酸，具有增强记忆，提高智力,降低血脂，调节免疫系统等功效，已经应用于临床和流行病学和食品添加剂^[1,4]。20世纪80年代发现，隐甲藻具有较高的产DHA能力^[2]，脂肪酸积累量高于20%，DHA含量占总脂肪酸的30%~50%，是一种高效的DHA生产菌^[2,3]，来源于隐甲藻的DHA克服了传统鱼油DHA所带有的鱼腥味、富含EPA、成本高等缺点^[6]，美国哥伦比亚Mertek公司已用该菌种实现了规模化生产。

 

虽然目前微藻生产DHA已工业化，但生物量和DHA的产量都相对较低^[3]，人们试图用多种方法去提高DHA产量，有优化光照条件，添加氧载体，寻找优良培养基成分，改造油脂性能等^[4]如何实现隐甲藻的高密度发酵是DHA生产的关键，各种培养基对隐甲藻培养产DHA影响较大，培养基优化是必要的^[4,5]。

 

发酵培养基是多成分，而且成分之间可能相互影响，单靠单因素和正交试验很难很快得到较好较严密的结果。单因素，Plackett-Burman，最陡爬坡，中心组合设计和响应面分析的依次设计是建立在多因素，多水平基础上，突出重要因子，步步逼近最大响应区，分析任何因子的一次项，平方项和任何两个因子间的一级交叉作用项的数学模型，近年来在培养基优化上使用很广。本文采取了用响应面的方法对培养基优化，以期提高隐甲藻的生物量并提高DHA产量。

 

 

1.1藻种：Crypthecodinium. cohnii ATCC 30556 由中国热带农业科学院热带生物研究所提供。

 

1.2培养基： 460（A₂E₆） 培养基(L^-1)如下：NaCl 23.48g，MgCl₂·6H₂O 10.63g，CaCl₂1.11g，Na₂SO₄3.92g，KCl 0.66g，NaHCO₃ 0.19g，H₃BO₃ 0.03g，SrCl₂·6H₂O 0.04g，Metal Mixture 3.0ml，FeCl₃·6H₂O 0.01g，甘油磷酸钠0.15g，Tris Buffer 3.0g，Vitamin solution 1.0ml，K₂HPO₄ 0.01g，Glucose 3.0g，甘氨酸1.5g。其中Metal Mixture如下：EDTA1.0g，FeCl₃·6H₂O 0.05g，H₃BO₃ 1.0g，MnCl₂·6H₂O 0.15g，ZnCl₂ 0.01g，CoCl₂·6H₂O 0.005g，H₂O 100mL。Vitamin solution如下：Biotin 0.003g，Thiamine 1g，H₂O 1L。

 

 

1.3.1菌种活化，培养及收集：取4℃保藏的菌种10%接入装液量5mL试管，25℃，150r/min培养两天后5%接种量转接到装液量10mL的摇瓶，25℃，150r/min培养两天作为实验的种子液。种子液以5%接种量接入装液量50mL的250mL摇瓶，25℃，150r/min培养5天收集菌体。10000r/min离心10min,蒸馏水清洗3次。-40℃，0.317帕，冻干称量至恒重。

 

1.3.2 脂肪酸提取：改进的Bligh--Dyer法^[9,10]。

 

1.3.3脂肪酸甲脂化^[13]

 

1.3.3色谱检测条件：采用Agilent 7890A气相色谱仪，FID检测器，19091N-113 HP-INNOWAX毛细管柱(30 m×0.32 mm×0.25μm)；载气为N₂，进样口温度250℃，检测器温度300℃。程序升温，130℃保温1 min，以5℃/min升温到250℃保温8 min，总运行时间33.00 min。

 

1.3.4计算方法^[11]：每个点做三次平行取平均值，数据处理和实验设计分别在Excel和Minitab辅助下完成

 

1.4单因素实验^[7]：以460medium为基础，外加甘油，酵母粉，胰蛋白粉，乙醇，研究其中含量较多和重要的8种成分，为PB实验设计作参考。

 

在单因素实验基础上，选取对DHA产量影响较大的8个因素，进行12次的Packett-Burman设计实验，筛选出重要影响因子。

 

对筛选出的因子根据方程进行最陡爬坡设计，以坡的最高点作为后续中心组合的中心点。

 

根据Box-Behnken的中心组合原理，设计合适的水平，中心点重复多次，用Minitab软件分析，对得到的理论最高点做3次重复验证。

 

 

对葡萄糖，甘油，乙醇，胰蛋白粉，酵母粉，氯化钠，氯化镁，维生素溶液8因子进行单因素实验。结果表明以上组分浓度分别为30(g/L)，20(g/L)，5(g/L)，5(g/L)，5(ml/L)，24g/L，10.4g/L，1ml/L时DHA产量分别达到最高为： 521.3±1.12(mg/L)，626.24±1.02(mg/L)，709.54±1.02(mg/L)，759.07±1.12(mg/L)， 812.78±1.12(mg/L)，835.32±0.98(mg/L)，855.77±1.02(mg/L)，860.12±1.00(mg/L)。依此为Packett-Burman设计合理的浓度水平，其中原始460培养基DHA产量365.48±1.12(mg/L)。

 

通过单因素实验，所选8因子对菌体量和DHA产量都较大影响，利用PB两水平对培养基8种成分进行考察，筛选重要因子，确定最佳方案，实验设计见表1。

 

表1　PB试验因素与水平

	A(g/L)	B(g/L)	C(g/L)	D(g/L)	E(ml/L)	F(g/L)	G(g/L)	H(ml/L)
	葡萄糖	甘油	酵母粉	胰蛋白粉	乙醇	氯化钠	六水氯化镁	Vitamin
-1	20	20	4	4	4	24	10.4	1
1	25	25	5	5	5	30	13	1.25

 

Packett-Burman实验结果见表2，用Minitab软件分析PB实验见表3，在99%置信区间下，A(葡萄糖)和D（胰蛋白粉）为影响显著因子。同时得到一次回归模型方程：Y= 851.236 +11.049A+ 6.306B+5.993C+17.99D-2.23E -6.269F -1.051G +0.289H （1），复相关系数R²=99.16%，拟合很好，8个因子对响应值的影响大小依次是：胰蛋白粉＞葡萄糖＞甘油＞氯化钠＞酵母粉＞乙醇＞氯化镁＞维生素溶液。

 

表2　PB试验方案与结果

 

表3　因素影响效果分析

       *”表示在99%置信区间内显著

 

根据PB实验可知，除了A(葡萄糖)和D（胰蛋白粉）以外，其他因子在99%的置信区间内DHA产量没有显著影响，E（乙醇），G（六水氯化镁），H（维生素溶液）效应值非常小，可以不加，所以维持其他组分保持低水平，对A(葡萄糖)和D（胰蛋白粉）进行最陡爬坡。由表4可知，最优条件在第五处理附近，因此以A(葡萄糖)浓度30g/l，D（胰蛋白粉）浓度5.0g/l作为后续响应面实验的中心点。  

 

表4  最陡爬坡实验设计和结果

处理	A	D	DHA(mg/L)
1	22	4.2	850.30±1.12
2	24	4.4	855.92±1.20
3	26	4.6	859.01±0.90
4	28	4.8	882.53±1.02
5	30	5.0	895.14±1.58
6	32	5.2	890.76±1.01
7	34	5.4	885.60±1.03
8	36	5.6	870.46±1.08
9	38	5.8	848.72±1.06
10	40	6.0	814.23±1.01

 

根据爬坡试验得到的中心点,对A和B进行中心试验组合设计。为使拟合方程具有旋转性和通用性,中心点重复5次，星号臂长γ= 1.414。自变量水平及编码见表5，试验设计及结果见表6 。        

             

表5  中心组合实验的变量和水平

因子（g/L）	水平
	-1.414	-1	0	1	1.414
A(葡萄糖)	27.2	28	30	32	32.8
D（胰蛋白粉）	4.78	4.8	5	5.2	5.52

 

表6　中心组合试验设计及试验结果

 

　                图1 响应面分析法(A,D)立体分析图A和相应的等高线图B

 

通过Minitab软件分析，各个因子的的偏回归系数估计值及方差分析结果见表7

 

表7　回归方程中回归系数的估计值及方差分析

项	系数	T	P
常量	907.003	1632.109	＜0.0001*
A	5.352	12.182	＜0.0001*
D	2.977	6.776	0.0003*
A*A	-9.258	-19.650	＜0.0001*
D*D	-6.439	-13.666	＜0.0001*
A*D	-3.291	-5.297	0.0011*

              *”表示在99%置信区间内显著

 

由此表可得到拟合的全变量编码水平的二次回归方程为:

Y=907.003+5.352A+2.997D-9.258A²-6.439D²-3.291A*D  （2）

该模型方程相关系数R²=0.9906，拟合很好。二次项,一次项和交叉项都影响显著。二次项系数为负，说明抛物面开口向下，有最大值。为了更直观地描述两因子对响应值的影响，做出模型（2）的等高线和曲面图（图1）。由此确定的A(葡萄糖)和D(胰蛋白粉)最佳浓度为30.54g/L和5.03g/L，DHA产量最大907.94mg/L。为了证实预测值和真实值之间的拟合程度，以预测浓度再做三次重复验证，生物量和DHA平均值为8.91±0.11g/L，907.54 ±1.02 mg/L拟合良好。从而确定最佳培养基的组成为30.54g/L，甘油20g/L，胰蛋白粉5.03 g/L，酵母粉4 g/L，不添加氯化镁和维生素，其他组分浓度同460培养基。

 

 

1原始的460培养基隐甲藻的生物量和DHA产量分别是3.32±0.12（g/L），365.48±1.12(mg/L)，通过培养基相关成分的筛选，得到一次拟合方程Y= 851.236 +11.049A+ 6.306B+5.993C+17.99D-2.23E -6.269F -1.051G +0.289H。所选的8种成分里葡萄糖和胰蛋白粉是显著影响因子，该结果与相关文献^[11,13]的报道一致。

 

2对筛选的显著效应因子葡萄糖和胰蛋白粉进行爬坡实验，不添加乙醇，氯化镁，维生素溶液，其他因子浓度保持在低水平，在处理5达到最大，此时葡萄糖和胰蛋白胨浓度分别为30g/L和5g/L，隐甲藻生物量和DHA产量分别达到8.88±0.24（g/L），895.14±1..58（mg/L），并以此为后续中心组合设计的中心点。

 

3根据Box-Behnken设计，确定2因素3个水平得到实验数据利用Minitab分析，得到回归方程：Y=907.003+5.352A+2.997D-9.258A²-6.439D²-3.291AD，该方程拟合良好，求解出葡萄糖和胰蛋白粉的浓度为30.54g/L，5.03g/L, DHA产量理论值为907.94mg/L。为了证实预测值和真实值之间的拟合程度，以预测浓度再做三次平行，生物量和 DHA分别为8.91±0.11g/L和907.54±1.02 mg/L，分别是优化前2.68和2.48倍，与理论值拟合良好，说明有实际指导作用。

 

4通过单因素，PB，最陡爬坡，Box-Behnken中心组合的依次设计的实验比纯粹的单因素和正交实验在理论水平上精细，严密，这样可以逐渐缩小优化范围，快速接近优化点而且能准确地用方程描述最佳控制条件^[14]。

 

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