人肥大细胞LAD2培养说明书

人肥大细胞LAD2培养条件

英文名称	LAD2	中文名称	人肥大细胞
生长特性	悬浮生长，部分贴壁	冻存条件	无血清冻存液
细胞背景	LAD2细胞从一位患有侵袭性肥大细胞增多症 (aggressive mastocytosis) 的 44 岁男性患者骨髓中分离的 CD34⁺造血干细胞培养而成
传代方法	1:2传代	传代情况	2~3天换液
备注	用无菌离心管收集瓶子培养基，留作过渡培养

人肥大细胞LAD2收到后处理
细胞在培养瓶中培养至良好状态后灌满完全培养液并封好瓶口是细胞运输的最好办法。收到细胞回到自己的实验室后，先打开外包装，用75%酒精喷洒整个瓶消毒后放到超净台内，严格无菌操作，培养箱静置2-4小时。镜下观察：未超过80%汇合度时，可将瓶装的完全培养液收集至离心管中，加入6ml完全培养基，放入37℃、5%CO2孵箱培养；超过80%汇合度时，根据情况传代或者冻存，具体操作见细胞培养步骤。（注意发货的是密封培养瓶的话，放入培养箱培养记得培养瓶盖子拧松）

人肥大细胞LAD2培养步骤
1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入5mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心5分钟，弃去上清液，补加4-6mL完全培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入6cm皿中），培养过夜。第二天换液并检查细胞密度。
2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。
1、对于悬浮细胞，传代可参考以下方法：
方法一：收集细胞，1000RPM条件下离心8-10分钟，弃上清液，补加1-2ml培养液后吹匀，将细胞悬液按1:2到1:5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或瓶中。
方法二：可选择半数换液方式，弃半数培养基后，将剩余细胞悬起，将细胞悬液按1:2到1:3的比例分到新的含8ml培养基新皿中或者瓶中。
3）细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。弃培养基后加入少量胰酶，细胞变圆脱落后，进行离心收集，1000RPM条件下离心8-10分钟，去除上清，按冻存数量加入血清及DMSO，冻存比例为90%FBS+10%DMSO
PS：若客户收到2ml小管细胞，收到细胞后，用75%酒精喷洒整个管子消毒后放到超净台或安全柜内，严格无菌操作；将小管细胞转移至T25培养瓶或6cm培养皿，加入5ml左右完全培养基混匀，放入培养箱过夜培养后查看细胞密度：若密度未超过80%，换液继续培养，视情况传代或者冻存。若密度超过80%，可直接进行传代（方法同上）。
3）细胞冻存：
1、细胞生长至覆盖培养瓶的80%面积时，弃25cm2培养瓶中的培养液，用PBS清洗细胞一次；
2、添加0.25%胰蛋白酶消化液约1ml至培养瓶中，倒置显微镜下观察，待细胞回缩变圆后加入完全培养液终止消化，轻轻吹打细胞使之脱落，然后将悬液转移至15ml离心管中，1000rpm离心5min；
3、用适量的冻存液重悬细胞，并放置于冻存管中；
4、先将细胞冻存管放置于-20℃ 1.5h，然后将其移入-80℃。