大鼠角膜成纤维细胞冻存后的传代时间依据
大鼠角膜成纤维细胞冻存复苏后，待细胞贴壁生长至汇合度80%-90%时即可进行传代，常规操作下复苏后2-3天可达到该传代标准。
一、传代时间判定依据
复苏后24小时完成首次换液，清除漂浮死细胞和残留DMSO，之后继续培养2-3天，细胞通过增殖铺满培养瓶底80%-90%的面积，此时细胞处于对数生长期，活性最佳，适合传代。
传代操作需严格遵循原代细胞低损伤原则，优先采用直接吹打法或HEPES辅助吹打法，避免胰酶过度消化损伤细胞。
二、传代操作规范
弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。
加入2ml 0.25%Trypsin-0.53mM EDTA消化液，37℃培养箱中消化1-2分钟，显微镜下观察大部分细胞变圆脱落时，立即加入完全培养基终止消化。
1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀，将细胞悬液按1:2到1:5的比例分到新的含8ml培养基的新培养瓶中。
三、注意事项
该细胞为原代细胞，传代比例推荐控制在1:2至1:3，不建议过度稀释，避免细胞密度过低导致生长停滞。
3代以内的细胞传代后状态稳定，超过5代后细胞易出现老化，不建议继续传代用于关键实验。
一、传代时间判定依据
复苏后24小时完成首次换液，清除漂浮死细胞和残留DMSO，之后继续培养2-3天，细胞通过增殖铺满培养瓶底80%-90%的面积，此时细胞处于对数生长期，活性最佳，适合传代。
传代操作需严格遵循原代细胞低损伤原则，优先采用直接吹打法或HEPES辅助吹打法，避免胰酶过度消化损伤细胞。
二、传代操作规范
弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。
加入2ml 0.25%Trypsin-0.53mM EDTA消化液，37℃培养箱中消化1-2分钟，显微镜下观察大部分细胞变圆脱落时，立即加入完全培养基终止消化。
1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀，将细胞悬液按1:2到1:5的比例分到新的含8ml培养基的新培养瓶中。
三、注意事项
该细胞为原代细胞，传代比例推荐控制在1:2至1:3，不建议过度稀释，避免细胞密度过低导致生长停滞。
3代以内的细胞传代后状态稳定，超过5代后细胞易出现老化，不建议继续传代用于关键实验。
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细胞
