PLA技术助力解析RBM10在DNA复制叉上的功能定位及其调控机制

在癌症研究领域，精准解析蛋白质与DNA的相互作用是理解肿瘤发生机制的关键。近年来，邻近连接分析技术 凭借其高灵敏度与空间分辨率，成为揭示蛋白-蛋白相互作用的重要工具。在《Nature Communications》发表的一篇关于肺腺癌中RBM10缺失与DNA复制压力的研究中，PLA技术发挥了不可或缺的作用，帮助科学家们首次揭示了RBM10在DNA复制叉上的功能定位及其调控机制。

PLA技术如何应用于RBM10研究？
研究中，作者通过多种PLA实验，系统性地验证了RBM10与DNA复制叉的物理邻近关系及其功能依赖性：

RBM10与PCNA的相互作用
使用PLA检测内源性RBM10与PCNA（复制叉标志蛋白）的相互作用，结果（Fig. 3b）显示RBM10与PCNA在细胞核内存在显著的邻近信号，证实RBM10位于活跃的DNA复制位点。

RBM10与新生DNA的共定位
结合EdU标记新生DNA，通过RBM10-EdU PLA实验，结果（Fig. 3c）直接证明RBM10与正在复制的DNA区域紧密相邻，进一步确认其在复制叉上的功能性存在。

PRIM1依赖的RBM10招募机制
通过敲低PRIM1（负责合成冈崎片段RNA引物的酶），结果（Fig. 3d）发现RBM10-EdU PLA信号显著减弱，表明RBM10的复制叉定位依赖于PRIM1介导的RNA引物。

Fig3. b, c 三次独立实验的代表性图像，显示H1299WT和H1299RBM10-KO细胞中的RBM10:PCNA (b) 和 RBM10:EdU-biotin (c) 邻近连接分析焦点。比例尺，20 µm。d 左图：用靶向PRIM1的siRNA (siPRIM1) 或对照siRNA (siCtrl) 转染的H1299WT细胞中RBM10:EdU-biotin PLA的代表性图像。比例尺，50 µm。右图：每个细胞核的RBM10-EdU-biotin PLA强度定量。水平条代表每次实验平均每个细胞核的PLA强度 ± SEM (siCtrl n = 206个细胞，siPRIM1 n = 225个细胞)。P值通过双尾Mann-Whitney检验确定。

RNA依赖性的验证
使用RNase H处理细胞后，结果（Fig. 3e） RBM10-EdU PLA信号明显下降，提示RNA分子（如冈崎片段中的RNA引物）在RBM10与复制叉结合中起关键作用。

Fig.3 e 实验条件同图d，不同之处在于在进行PLA实验前，载玻片使用了RNaseH进行处理（未处理组n=222个细胞，RNaseH处理组n=207个细胞）。比例尺为50µm。f 实验条件同图d，不同之处在于使用了表达Flag-RBM10WT、Flag-RBM10ΔZNF1或空载体（VO）的H1299RBM10-KO细胞（nWT=191, nVO=183, nRBM10-WT=354, nRBM10-ΔZNF1=310, nRBM10-ΔRRM2=130个细胞）。比例尺为20µm。

结构域功能分析
通过构建RBM10缺失突变体，结果（Fig. 3f）发现缺失ZnF1结构域（具有RNA结合能力）的突变体无法定位到复制叉，而缺失RRM2结构域（与剪接相关）的突变体则无影响，说明RBM10的复制功能独立于其剪接活性。

HDAC1招募与组蛋白修饰调控
进一步利用PLA揭示（Fig. 3h-i）:RBM10缺失导致HDAC1在复制叉上的定位丧失，进而引起H4K16乙酰化水平升高和R-loop积累，最终导致复制压力。

Fig3. h, i 左图：H1299WT和H1299RBM10-KO细胞中HDAC1:EdU-biotin (h) 和 H4K16ac:EdU-biotin (i) 邻近连接分析的代表性免疫荧光图像。细胞分为未处理(UT)组和HU处理组。比例尺为20µm。右图：每个细胞核的PLA信号强度定量分析。水平条代表三次独立实验中每个细胞核的平均PLA强度 ± 标准差（HDAC1:EdU PLA—WT-UT组106个细胞，WT-HU组144个细胞，KO-UT组119个细胞，KO-HU组129个细胞；H4K16ac:EdU PLA—WT-UT组110个细胞，WT-HU组134个细胞，KO-UT组125个细胞，KO-HU组109个细胞）。P值通过双尾Mann-Whitney检验确定。j 左图：S9.6抗体检测H1299WT和H1299RBM10-KO细胞中R环的代表性图像。比例尺为10µm。右图：H1299WT和H1299RBM10-KO细胞中S9.6信号强度定量分析。水平条代表三次独立实验中每个细胞核的平均信号强度 ± 标准差（WT未处理组76个细胞，WT+RNaseH处理组88个细胞，KO未处理组68个细胞，KO+RNaseH处理组86个细胞）。P值通过双尾Mann-Whitney检验确定。源数据详见源数据文件。

PLA揭示的关键结论
RBM10通过PRIM1和RNA引物被招募至复制叉，其ZnF1结构域是关键。
RBM10在复制叉上招募HDAC1，促进H4K16去乙酰化，维持复制叉稳定性。
RBM10缺失导致R-loop积累和复制压力，进而增强对WEE1抑制剂MK1775的敏感性。

PLA技术的扩展应用
本研究不仅深化了对RBM10功能的理解，也展示了PLA技术在以下方面的广泛应用潜力：
蛋白质与DNA/RNA相互作用的可视化研究
复制叉成分的动态招募机制解析
表观遗传修饰因子在复制过程中的定位分析
药物靶点机制验证与合成致死策略的分子基础研究
PLA技术的高通量、高特异性使其成为未来癌症机制研究与靶向治疗开发中的重要实验手段。

参考文献：
Machour, F.E., R. Abu-Zhayia, E., Kamar, J. et al. Harnessing DNA replication stress to target RBM10 deficiency in lung adenocarcinoma. Nat Commun 15, 6417 (2024). https://doi.org/10.1038/s41467-024-50882-0