多光片RESOLFT实现活细胞三维超分辨成像

关键词：多光片RESOLFT；活细胞成像；轴向超分辨

光片荧光显微镜是多细胞体系四维生物成像的重要工具，具有体积成像速度快、光毒性低的优势，但传统光片厚度通常在微米量级，难以在活细胞中提取精细的亚细胞结构信息。本文利用可逆开关荧光蛋白在不同光照下可反复切换荧光态的特性，结合周期性光调控照明，提出一种名为多光片 RESOLFT 的超分辨成像方法。该方法在样本内同时刻录多条亚衍射极限厚度的受限光片，以平行方式并行采集体积信号，实现了亚细胞结构的快速体积超分辨成像，时间分辨率达到每秒 1 至 2 帧，轴向切片能力优于 100 纳米，并可在活细胞中长时间追踪多种动态生物学过程。

该工作由 Andreas Bodén、Dirk Ollech、Andrew G. York、Alfred Millett-Sikking 与 Ilaria Testa 共同完成，论文题为 "Super-sectioning with multi-sheet reversible saturable optical fluorescence transitions (RESOLFT) microscopy"，发表于Nature Methods。

重要发现

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多光片刻录与成像原理

多光片RESOLFT 成像的核心思路是在整个待成像体积内同时刻录多条平行的亚衍射极限光片，再通过斜角检测光路一次性读出全部光片所在平面的荧光信号。整个记录循环分为三个阶段：开启刻录、多光片并行记录和扫描重建。

开启阶段采用宽场照射，将样本内可逆开关荧光蛋白批量切换至荧光开启态。随后进入关闭照明阶段：一束经正弦干涉调制的周期性光场以特定间距投射入样本，该干涉图案的周期间距约为1.2 微米，比传统光片薄数十倍。光场强度较高的位置将附近的荧光蛋白关闭，强度为零的位置则保留开启态荧光蛋白，从而在样本中留下一系列厚度极薄、紧密受限的开启态光片。这些受限光片沿轴向紧密排列，相邻光片的间距略大于检测光路的焦深，确保每一条光片发出的荧光都能被斜角检测物镜同时收集。

记录阶段完成后，切换至常规读出照明，一次性读取所有受限光片的荧光信号。由于一次读出即可覆盖整个体积中的多个平面，无需像传统光片显微镜那样逐片扫描，大幅缩短了体积采集时间。

02

光学系统与重建方法

为验证该成像方案，研究团队搭建了基于斜平面检测的专用光学平台。系统采用高数值孔径检测物镜以提升横向分辨率，激发光路与开关光路分别独立调制。488 纳米激光用于荧光读出激发，405 纳米激光用于开启态刻录，关闭照明则通过衍射光栅与周期性相位模板产生干涉光场。检测端采用两通道并行采集，以适应不同荧光蛋白的发射光谱。

重建算法分为两步：第一步为简单去倾斜重建，将斜角采集的图像重新对齐至标准笛卡尔坐标系；第二步引入基于光片先验信息的Richardson–Lucy 反卷积迭代，进一步压缩受限光片的有效厚度并抑制离焦背景。反卷积过程利用已知的受限光片厚度和点扩散函数作为先验约束，迭代次数可达十次，显著提升了体积图像的轴向对比度。

03

成像性能表征

在性能测试中，多光片RESOLFT 系统在固定样本上实现了约 250 纳米的横向分辨率和约 200 纳米的轴向分辨率，检测点扩散函数尺寸小于 200 纳米。受限光片的有效厚度可通过调节关闭照明的功率和持续时间进行调谐，实验中将光片厚度压缩至约 100 至 200 纳米，比传统光片的 1 至 1.5 微米薄一个数量级以上。

时间分辨率方面，最快体积成像记录达到约0.5 秒每个体积，对应约 2 赫兹的体速，成像体积约为 57 × 42 × 8 微米立方。在使用较慢的光开关蛋白时，采集时间为每个体积 2 至 5 秒，对应体积约 100 × 80 × 15 微米立方。研究指出，通过提升激光功率和开发更快的相机，成像速度有望进一步显著提升。

04

活细胞动态成像验证

研究团队将该技术应用于多种活细胞体系，验证了其在亚细胞动态观测中的实用性。

在微管网络成像中，转染微管相关蛋白标记的细胞体积被连续采集400 个时间点，体积约 90 × 42 × 11 微米立方。与传统斜平面光片成像相比，多光片 RESOLFT 模式下轴向受限光片将有效光片厚度压缩至约 200 纳米，达到了约 250 纳米的横向分辨率和约 200 纳米的轴向分辨率，清晰分辨出以往模式下模糊重叠的微管纤维结构。

在肌动蛋白细胞骨架的长时间时间序列成像中，一个较大的细胞群落被体积记录超过29 分钟，共 30 个时间点，信号强度在整个记录过程中保持稳定，证明了该方法在长时间活细胞观测中的光毒性可控性。

在细胞分裂过程成像中，组蛋白标记的细胞被每15 分钟记录一次，持续超过 4 小时，完整捕捉了染色质在有丝分裂过程中的凝聚、分离与去凝聚全过程，确认了子细胞的正常分裂与后续生长。

在病毒样颗粒成像中，研究人员观察到细胞质中病毒蛋白的聚集、向质膜的运输以及在顶端质膜处的出芽过程，时间分辨率足以追踪单个病毒样颗粒在膜附近的运动轨迹。此外，线粒体网络的分裂与融合事件也被成功记录，整个细胞网络在60 个时间点中被完整追踪。

创新与亮点

该技术突破的核心难题是传统光片显微镜轴向分辨率受光片厚度与传播距离固有限制的瓶颈。以往斜平面光片虽然数值孔径较高，但光片厚度通常在1 至 1.5 微米，限制了三维亚细胞结构的分辨能力。多光片 RESOLFT 利用可逆开关荧光蛋白的双稳态特性，将光片厚度压缩至亚衍射极限量级，同时保持了光片成像低光毒性、高体速的优势。

其新成像技术的关键在于多光片并行刻录与并行读出：一次开关循环即可在整个体积内生成多条受限光片，一次读出即可采集全部平面信号，从而将体速提升至每秒1 至 2 帧，比以往同类超分辨体积成像方法快约一个数量级，且每个体积仅需约 10 至 20 次开关循环，最大限度减少了光漂白与光毒性。

在光学生物医疗领域，该技术为活细胞内亚细胞过程的三维动态观测提供了新工具，适用于细胞分裂、骨架重塑、病毒出芽、线粒体动力学等需要长时间、高时空分辨率的研究场景，为高通量活细胞超分辨体积成像奠定了基础。

总结与展望

本文开发的多光片RESOLFT 显微镜以约 1 至 2 赫兹的体速实现了百纳米级三维分辨率的体积成像，兼顾了超分辨能力与活细胞长时间观测的兼容性。未来随着激光功率提升、更快相机的发展以及多色成像方案的拓展，该技术有望进一步提升时空分辨率与成像通量，并与组织透明化、大样本成像等方向结合，在更复杂的生物体系中发挥作用。

论文信息

声明：本文仅用作学术目的。 

Bodén, A., Ollech, D., York, A.G. et al. Super-sectioning with multi-sheet reversible saturable optical fluorescence transitions (RESOLFT) microscopy. Nat Methods 21, 882–888 (2024).

https://doi.org/10.1038/s41592-024-02196-8