PEI 转染细胞活率下降、结团、碎片增多等问题的排查与实操流程

摘要：PEI 是哺乳动物细胞瞬时转染常用载体，实验时常出现细胞活率下降、结团、碎片增多等不良现象。本文区分三类异常表现，解析复合物配比、细胞状态、试剂配制等诱因，给出判别手段与实操排查流程，帮助建立稳定可重复的 PEI 转染体系。

关键词：PEI 转染、聚乙烯亚胺、细胞活率、转染复合物、转染细胞结团、瞬时转染、HEK293T、DNA‑PEI 比例、悬浮细胞转染

PEI（聚乙烯亚胺）是哺乳动物细胞瞬时转染中常用的阳离子聚合物载体。它操作简便、成本较低、可重复性好，并能适配从培养皿到生物反应器的不同规模，在实验室研究和瞬时蛋白表达中应用较多。

在体系优化到位的情况下，PEI 转染（点击查看）可以在维持较高细胞活率的同时获得理想的转染效果。实际操作中偶尔遇到的活率下降、细胞结团或碎片增多，通常不是 PEI 本身的问题，而是细胞状态、复合物制备或培养条件等某个环节没有匹配好的信号。找准原因并做相应调整，多数情况都能得到改善。本文把三类常见现象拆开，说明如何判断、从哪里入手优化。

一、先分清三类现象

表 1. PEI 转染中活率下降、结团与碎片的排查与优化

细胞碎片通常是结果而不是原因。当观察到碎片增多时，先确认细胞状态从何时开始变化，往往比直接处理碎片更有效。

二、活率下降：多为条件失衡的信号
在优化好的体系中，PEI 转染的细胞活率可以保持在较高水平。如果转染后活率明显下降，通常意味着某个条件超出了当前体系的合适范围。常见原因和对应做法如下。

（一）复合物用量或比例需要调整。PEI 与 DNA 结合后，会有少量未结合的 PEI 游离在体系中。在合适用量下，这部分游离 PEI 对细胞状态的影响有限；当用量明显偏高时，游离 PEI 增多，可能与细胞膜作用而影响细胞状态。不同细胞系和不同类型 PEI（线性或支化、不同分子量）的合适用量区间并不相同。因此，固定细胞密度、在小范围内摸索 DNA 用量与 PEI/DNA 比例，找到兼顾活率与转染效果的区间，是常用的优化方法。

图 1. 不同 PEI 用量下 HEK293T 细胞的 GFP 表达（对照、PEI1:2、PEI1:3）。固定细胞密度、在小范围内摸索用量，可找到兼顾活率与转染效果的区间。Akgöl S, Yetim E, Kalkan BM, Kocabaş F. Development of gene editing strategies for CCR5 gene in endothelial cells. Gene Editing. 2021;2:22-30.

（二）细胞状态与密度。处于对数生长期、活率高的细胞，转染后状态更稳定；细胞老化、汇合度过高或传代次数较多时，转染后更容易出现活率下降。转染时把细胞密度控制在合适范围，并使用状态良好的细胞，往往能减少这类问题。

（三）培养液与营养状态。当培养液已经耗竭、营养不足时，复合物更容易聚集，转染后细胞状态也会受影响；在转染前更换新鲜培养液，可以部分补偿这一影响，操作简单，通常值得先做。

（四）正确看待用量与转染效果的关系。PEI 的转染能力来自其阳离子特性，这是它结合、压缩 DNA 并把 DNA 送入细胞的基础。因此，优化的目标不是一味减少 PEI，而是找到合适的平衡点，在这个点上，转染效果和细胞活率可以同时达到较好水平，二者并非只能取其一。有研究在去除游离 PEI 后观察到细胞状态改善，但在较低 DNA 用量下转染效果也随之下降，正说明了合适用量的重要性。

三、细胞结团：先判断团块成因
细胞结团有不同来源，处理方式也不同。
（一）复合物聚集。复合物的稳定性对稀释环境敏感。在含磷酸根的稀释液（如 PBS）中，复合物粒径容易增大、出现絮状或浑浊；在等渗氯化钠溶液中则相对稳定。这类问题属于复合物制备环节，选择合适的稀释液、现配现用即可避免。

（二）复合物的桥连作用。表面正电荷较强的复合物可能与细胞膜上的负电荷发生多位点结合，使相邻细胞靠拢，该现象在悬浮培养中相对容易出现。

（三）细胞自身的生长性结团。部分细胞系在悬浮培养中本身倾向于结团。保持单细胞状态有助于复合物与细胞均匀接触，转染更充分；结团细胞的转染效果往往低于单细胞。维持良好的细胞状态，也有助于减少因细胞内容物释放而加剧的结团。

区分方法
1. 团块内是否存在形态完整的细胞：若存在，偏向细胞因素；若仅为折光物质，偏向复合物聚集。
2. 团块出现于加入复合物之后还是转染之前：若转染前已存在，应先处理细胞状态。
3. 镜下是否先出现絮状物、后出现细胞结团：若是，则复合物聚集在先。

抗结团剂的使用注意
在悬浮培养中可使用抗结团剂。这类试剂通过改变细胞表面电荷减少黏附，可能干扰阳离子转染复合物的形成与进入细胞，因此厂家通常建议在转染时提前去除抗结团剂，避免影响转染效率。

四、碎片：多为结果，重点在前端
培养液中的碎片主要分为两类。
第一类为细胞裂解后的残留物及释放的核酸，镜下多呈粘丝状、团块边缘毛糙，出现时间晚于细胞状态变化。这类碎片会随细胞状态改善而减少，重点在于前端的细胞状态控制。

第二类为未完全溶解或析出的 PEI 及复合物，镜下多呈细小颗粒或折光物，出现时间可能早于细胞变化，甚至在加入细胞之前。若属于此类，问题出在试剂配制或复合物制备环节，规范配制即可避免。

判断时，可先确认碎片是否早于细胞变化出现，再观察换液后是否减少；若均不成立，应核查母液的配制与保存状态。

五、系统优化，让转染更稳定
遇到细胞状态不佳时，按一定顺序排查，比在单一参数上反复调整更有效。
先做小范围优化。固定细胞密度，设置少量梯度摸索 DNA 用量和 PEI/DNA 比例，以活率和转染效果同时较优的区间作为后续条件。

把基础条件做稳定。选用代数低、处于对数生长期、活率高的细胞，统一复合物制备流程，使用合适的稀释液并现配现用，必要时在转染前更换新鲜培养液，也可在转染后 18-24 小时进行换液操作。

避免在单一参数上此消彼长。如果调整 PEI 用量后，活率与转染效果只是一升一降，说明需要从细胞状态、复合物制备、培养条件等系统层面入手，而不是继续在同一参数上调整。

图 2. PEI 转染优化流程

具体用量、比例和时间没有可以照搬的通用数值，它们随细胞系、PEI 产品类型和培养方式而变化。按“细胞状态—复合物制备—培养条件”的顺序逐步排查，多数体系都能找到稳定、可重复的转染条件。