PaK细胞系源自银鲳（Pampus argenteus）肾脏组织，属海水鱼类来源细胞，贴壁生长，形态以成纤维样与上皮样细胞为主（原代培养可见少量巨噬细胞混杂）。该细胞在DMEM/F-12培养基中添加20% FBS的条件下贴壁与增殖效果最佳，最适培养温度为24-28℃，是鱼类免疫学、病原—宿主互作及鱼类病毒分离增殖研究的重要体外模型。与哺乳动物细胞相比，鱼类细胞培养对温度、渗透压的耐受范围更宽且通常不依赖CO₂环境，培养中需重点把控培养温度与血清比例，以维持细胞良好状态。本文将针对PaK的细胞培养流程进行梳理和指导。
一、细胞复苏
1.【准备工作】配制完全培养基：DMEM/F-12（abs9561-500ml/SV30307.01） + 20%FBS（abs972-500mL/SV30302.03）+1%P/S（abs9244-100ml/SV30010），取9mL完全培养基于26-28℃预热。水浴锅预热至37℃（冻存细胞快速解冻用）；生物安全柜紫外照射30min。
2.【融化】从液氮/冰箱取出冻存管，37℃水浴快速摇晃融化，约1-2min。
3.【重悬】75%酒精擦拭冻存管外壁，安全柜内开盖，将细胞悬液沿管壁缓慢滴入含9mL预热完全培养基的离心管中，轻柔混匀。
4.【离心】300×g离心5min，弃上清，去除DMSO残留。
5.【重悬】加入1-2mL完全培养基轻轻吹打重悬；接种T25培养瓶（加入5-6mL完全培养基），十字混匀，标注名称、代次、日期。
6.【培养】放入26-28℃培养箱静置培养，次日换液，去除死细胞碎片。
二、细胞传代
1.【实验准备】配制完全培养基：DMEM/F-12（abs9561-500ml/SV30307.01） + 20%FBS（abs972-500mL/SV30302.03）+1%P/S（abs9244-100ml/SV30010）。提前取出PBS（abs962-500ml/SV30305.01）、完全培养基、0.25%胰酶-EDTA（abs47047375-100mL/SH30042.01），恢复至室温；生物安全柜提前使用紫外照射30min。
注意：鱼类细胞培养温度为26-28℃，切勿放入37℃培养箱；培养基渗透压需维持在250-350 mOsm/kg。
2.【镜检】融合度达80%-90%时传代，细胞铺展饱满、形态均一即可操作。
3.【细胞清洗】吸弃旧培养基，沿瓶壁缓慢加入2-3mL PBS（abs962-500ml/SV30305.01），轻摇覆盖，吸弃。
4.【细胞消化】加入0.25%胰酶-EDTA（abs47047375-100mL/SH30042.01）覆盖瓶底，室温或26℃消化1-3min，镜下见细胞回缩变圆即加完全培养基终止。
注意：鱼类细胞贴壁相对较牢，若消化不充分可适当延长并轻敲瓶壁；消化后轻柔吹打，避免产生气泡。
5.【离心】300×g离心5min（约1000rpm），弃上清；加入完全培养基轻轻吹打重悬。
6.【传代】按1:2-1:3接种至新瓶，补加完全培养基至工作体积，十字混匀，标注信息。
7.【镜检】镜下确认分散均匀，放入26-28℃培养箱，24-48h观察细胞状态。
注意：温度是鱼类细胞培养的首要变量：低于20℃生长显著变慢、高于30℃易受抑制；换液频率约2-4次/周。原代或低代次PaK中可见巨噬细胞等混杂细胞，随传代逐渐纯化；如出现成纤维细胞过度生长，可用差速消化法纯化。
三、细胞冻存
1.【准备工作】冻存液：无血清细胞冻存液（abs9417-100mL）或DMEM/F-12（abs9561-500ml/SV30307.01）+20% FBS（abs972-500mL/SV30302.03）+10% DMSO（abs9187-100mL）；冻存管标注名称、代次、冻存人、日期；安全柜紫外照射30min。
2.【细胞收集】融合度80%-90%时按传代步骤消化收集，300×g离心后弃上清。
3.【细胞重悬】加入冻存液（约1mL/管）轻柔吹打重悬，细胞密度约1-5×10⁶/mL。
4.【冻存】每管1mL入冻存盒，-80℃过夜后转移至液氮罐长期保存；鱼类细胞复苏存活率约70%，建议一次冻存多管。
四、关键注意事项
1.温度控制（首要因素）
（1）适宜温度26-28℃，严禁按哺乳动物细胞置于37℃培养；
（2）低于20℃传代周期显著延长，高于30℃生长受抑制；
（3）使用专用低温培养箱并每日记录温度波动。
2.培养基与渗透压
（1）推荐DMEM/F-12 + 20%FBS，血清低于10%时增殖明显下降；
（2）鱼类细胞渗透压需维持250-350 mOsm/kg；
（3）建议使用优级胎牛血清（abs972-500mL/SV30302.03）并固定批号。
3.原代污染与纯化
（1）肾脏原代培养常混有巨噬细胞、成纤维细胞，需多次传代纯化；
（2）鱼类组织易携带支原体与细菌，建议加双抗并使用庆大霉素，定期检测；
（3）如成纤维细胞过度生长，可用0.05%胰酶差速消化收获目标上皮样细胞。
4.形态与污染判断
（1）正常：上皮样/成纤维样贴壁生长，形态均一，铺展饱满；
（2）异常：大量漂浮、细胞圆缩脱落、培养基浑浊（污染）。
