利用RRBS等揭示人类精子的DNA甲基化稳定性机制

通过辅助生殖技术（Assisted Reproductive Technology，ART）孕育的子代，可能与DNA甲基化异常相关的疾病风险更高；培养液成分可在体细胞中调节DNA甲基化，因此该风险可能源于精子培育过程中的培养液因素。那么在体外培养环境中的成熟精子DNA甲基化是否发生改变呢？

近日，丹麦哥本哈根大学Romain Barrès教授团队在著名生殖医学期刊《Human Reproduction Open》发表题为“In vitro incubation of human sperm does not change DNA methylation”的科研论文。研究以简化DNA甲基化测序（RRBS）为核心技术平台，对15名男性的精子分别在对照培养液、含H2O2（氧化应激诱导剂）培养液、含棕榈酸（palmitate，脂肪酸）培养液中培育24小时后的DNA甲基化图谱，并与培育前精子样本进行对比。同时结合靶向蛋白质组学，检测成熟精子中是否存在DNA甲基化修饰相关酶类。

研究结果表明，人类成熟精子的DNA甲基化组在体外培养条件下高度稳定，即使在氧化或代谢应激下也未出现显著甲基化变化。因此ART技术操作本身不太可能直接改变精子甲基化，ART子代中观察到的表观遗传改变更可能发生于受精之后或源于母体健康、携带既有表观遗传异常精子选择等因素。
 

标题：In vitro incubation of human sperm does not change DNA methylation（体外培养人类精子不会改变DNA甲基化）
发表时间：2026-09-11
发表期刊：Human Reproduction Open
影响因子：IF8.6/Q1
技术平台：RRBS、蛋白质组学
作者单位：哥本哈根大学、法国国家科学研究中心
DOI:10.1093/hropen/hoag079

结果图形

图1：跨物种综合精子蛋白质组分析揭示其保守性、功能富集和表观遗传调控因子

（A） 靶向精子蛋白质组分析示意图
（B-C） 本研究中鉴定的精子蛋白质数量与先前报道的数据集比较维恩图
（D） 参与表观遗传调控、RNA定位和染色质重塑中的保守精子蛋白，证实其在精子功能和受精能力中的潜在作用
（E-G）保守精子蛋白的KEGG通路和生物过程富集分析
（H） 小鼠、公羊、公猪、公牛、兔子、海豚、考拉、鳄鱼鉴定出的精子蛋白的跨物种比较，揭示保守的核心蛋白组及人类特异性差异

（2）精子DNA甲基化模式在体外培养24小时后保持稳定
H2O2与棕榈酸已被证明可导致非分裂细胞的快速DNA甲基化变化，因此本研究以二者作为应激条件。15名参与者的精液量、浓度、总数均在WHO参考范围内，但9人总活动力低于正常；应激条件下精子死亡率与存活率显著降低，以H2O2处理最为明显，说明精子功能确实受到影响。

RRBS平均测序深度25.3M reads，CpG富集区覆盖度中位数约100×，覆盖呈现RRBS典型的CpG密集区富集特征（启动子、外显子、内含子、CpG岛、shore、shelf）。聚类分析显示培育前后甲基化图谱高度一致，DMRs无显著差异。

图2：不同培养条件不改变精子DNA甲基化谱

（A） 从原精液中分离活动精子及随后在对照/H2O2/棕榈酸培养液中培育24小时的实验示意图
（B） 不同条件下的时序性精子活力（左）与存活率（右）
（C） DNA甲基化覆盖的基因组分布
（D） CpG位点甲基化的双峰分布
（E） 多维标度分析（MDS）DNA甲基化水平，显示基于处理和培养状态的样本无分离
（F） 培养前后比较分析鉴定到的DMRs及其代表性位点

（3）印记区与转座区不受培养液中24小时培养的影响
印记区甲基化变化与ART子代印记障碍发生率升高相关，且这些位点也可能在ART操作中发生差异甲基化。因此，研究者重点分析H19、KCNQ1、MEG3、DIRAS3、SNRPN与GRB10等6个印记区域。结果显示，在所有4中不同培养条件下的位点平均CpG甲基化均保持稳定。并通过靶基因甲基化验证证实各处理间无显著甲基化变化，表明印记标记对人类精子短期环境应激具有韧性。
 

图3：印记基因位点的DNA甲基化在应激条件下保持稳定

（A-F）印记基因区域（H19、KCNQ1、MEG3、SNRPN、DIRAS3和GRB10）的平均CpG甲基化水平
（G） 不同条件下每个位点的平均CpG甲基化水平箱线图。各处理组间未观察到显著差异，表明印记位点甲基化稳定性强

（4）应激条件下转座元件DNA甲基化的稳定性
转座元件（TEs）约占人类DNA的近一半，其受DNA甲基化调控以防止激活和维护基因组稳定。作者分析了应激条件下人类精子TE的DNA甲基化稳定性，探索其是否受短期氧化或代谢应激影响。
 

图4：应激条件下转座元件DNA甲基化保持稳定

（A） 主要人类转座元件（TE）家族的环状系统发育树，按短散布核元件（SINE）、长散布核元件（LINE）、长末端重复序列（LTR）、DNA转座子类别分类，并标注进化年龄
（B） 人类染色体上的TE分布，突出转座元件密度差异
（C） RRBS捕获的TE比例，按TE类别分层
（D） 不同条件下各TE类别（LINE、SINE、LTR、DNA转座子）的平均DNA甲基化水平
（E） 按进化年龄分层的TE甲基化
（F-G） 代表性基因组区域（位于chr19和chr17）的基因组浏览器视图

结论和启示
本研究通过RRBS等技术揭示了成熟人类精子在对照培养液、H2O2培养液、棕榈酸培养液等不同培养条件下的DNA甲基化组保持稳定，提示对环境应激的DNA甲基化变化可能发生在精子发生的更早期阶段。

本研究揭示印记位点等精子DNA甲基化图谱保存良好，不太可能直接被ART中的配子操作影响；ART子代中出现的表观遗传改变更可能发生在受精之后，而非源于精子甲基化本身变化。

参考文献：
Kjøller ET, Dumargne MC, Ingerslev LR, Manitta E, Dehestani Y, Saupstad M, Gonzalez-Franquesa A, Deshmukh AS, Andersen E, Barrès R. In vitro incubation of human sperm does not change DNA methylation. Hum Reprod Open. 2026;2026(4):hoag079. doi: 10.1093/hropen/hoag079.