MEL为病毒诱导建立的小鼠红白血病细胞，形态呈淋巴母细胞样、圆形，悬浮生长，易形成松散细胞团，染色体数目35-44条，倍增时间约18-24h。在DMSO等诱导剂处理下，该细胞可向红系分化并合成血红蛋白，是研究红细胞分化机制、血红蛋白合成调控、白血病病理及促分化药物筛选的经典模型。MEL属于悬浮细胞，培养全程无需胰酶消化，传代方式与贴壁细胞差异显著，采用离心-重悬-稀释模式；同时需要严格把控培养密度窗口，密度过高或过低均会快速造成细胞状态劣变。本文将系统梳理MEL细胞的标准化培养流程。
一、细胞复苏
1.【准备工作】配制完全培养基：RPMI 1640 （abs9484-500mL/SV30306.01）+10% FBS（abs972-500mL/SV30302.03）+1% P/S（abs9244-100ml/SV30010），于37℃预热；水浴锅预热至37℃；生物安全柜紫外照射30min。
2.【融化】从液氮取出冻存管，37℃水浴轻柔摇晃融化，约2min；融化期间保持管盖与O型圈在水面之上，减少污染风险。
3.【离心】内容物融化后立即取出，70%乙醇擦拭或浸洗消毒外壁；将细胞悬液转入含9mL完全培养基的离心管中，约1000rpm离心3-5min，弃上清去除DMSO。
4.【重悬】加入1-2mL完全培养基轻轻重悬（悬浮细胞吹打轻柔即可，无需机械辅助），接种至T25培养瓶，标注名称、代次、日期。悬浮细胞接种后呈均匀悬液，瓶底无贴壁为正常。
5.【培养】放入37℃、5%CO₂培养箱静置培养，T25瓶瓶盖拧松或使用透气盖以保证气体交换。
注意：悬浮细胞复苏当天不做离心换液，次日再全量换液去除死细胞与DMSO残留；复苏后24-48h内密度可能偏低，属正常，按密度窗口维持即可。
二、细胞传代
1.【实验准备】配制完全培养基：RPMI 1640 （abs9484-500mL/SV30306.01）+10% FBS（abs972-500mL/SV30302.03）+1% P/S（abs9244-100ml/SV30010）。培养基37℃预热；生物安全柜紫外照射30min。悬浮细胞传代不需要胰酶、不需要PBS润洗。
2.【镜检】维持细胞密度在1×10⁵-1×10⁶个/mL之间；低于1×10⁵个/mL生长迟缓，高于2×10⁶个/mL则快速进入死亡；通常每2天按1:8-1:10稀释传代一次。
3.【混匀取样】轻柔吹打使细胞悬液均匀（MEL呈松散团块，不必打散为单细胞，均匀取样计数即可），取少量计数活率。
4.【离心收集】将细胞悬液转入离心管，约1000rpm离心3-5min（或150-300×g，5min），弃上清。
5.【稀释传代】加入新鲜完全培养基，按1:8-1:10的比例稀释接种至新瓶（使终密度回到约1-2×10⁵个/mL），十字混匀，标注信息，放回培养箱。
注意：MEL为悬浮细胞，全程不使用胰酶；偶见少量细胞贴壁，轻晃培养瓶或轻柔吹打即可将其带回悬液，属正常现象，无需处理。
三、细胞冻存
1.【准备工作】冻存液：90% FBS（abs972-500mL/SV30302.03）+10% DMSO（abs9187-100mL），现用现配；如使用无血清细胞冻存液（abs9417-100mL）可省去程序降温步骤。冻存管标注名称、代次、冻存人、日期；安全柜紫外照射30min。
2.【细胞收集】取对数生长期、密度约5×10⁵个/mL的细胞，离心收集，弃上清。
3.【细胞重悬】加入预冷冻存液轻柔重悬，细胞密度约5×10⁶-1×10⁷/mL（该细胞冻存密度可偏高）。
4.【冻存】每管1mL入冻存盒，-80℃过夜后转移至液氮气相长期保存。
注意：-70℃存放会导致活力丧失，不可长期置于-80℃。
四、关键注意事项
1.培养基与血清
（1）标准配方为RPMI-1640+10% FBS，常规扩增与DMSO诱导分化无需热灭活，若开展补体、免疫相关功能实验，血清可经56℃ 30min 热灭活处理，悬浮细胞对血清中补体与内毒素更敏感；
（2）部分方案使用DMEM高糖（abs9483-500ml/SV30303.01）培养MEL（如DS19亚系），两种体系均可，但同一实验内不要混用；
（3）固定血清批号；悬浮细胞的密度动力学对血清批次变化较为敏感，换批前先平行验证。
2.密度窗口
（1）密度是MEL培养成败的第一变量：维持1×10⁵-1×10⁶个/mL；低于下限生长停滞，高于2×10⁶个/mL活力迅速下降；
（2）对数生长期倍增时间约18-24小时，密度接近上限时务必及时稀释；若需暂停实验，可将细胞稀释至1×10⁵个/mL并缩短观察间隔；
（3）每天镜检计数，不要凭培养液颜色判断密度—MEL代谢旺盛，颜色变黄可能已经过密。
3.悬浮细胞操作要点
（1）全程不使用胰酶与PBS润洗；传代即稀释，流程为混匀-计数-离心-重悬-稀释；
（2）MEL呈松散团块生长，计数前轻柔吹打混匀即可，不必强行打散为单细胞，过度吹打会降低活率；
（3）离心力不宜过大，150-300×g足够；离心过猛会增加碎片；
（4）瓶盖拧松或用透气盖，保证气体交换；悬浮细胞瓶可直立放置以增大气体交换面积。
4.红系分化诱导
（1）经典诱导方案：加入DMSO（abs9187-100mL）至终浓度2%，维持培养3-5天即可向红系分化、合成血红蛋白；
（2）诱导后细胞生长减慢，只需在第2-3天按1:2稀释；离心后细胞团明显变红是分化成功的直观判据，随天数增加颜色加深；
（3）联苯胺染色可定量血红蛋白阳性细胞比例；诱导实验需设溶剂对照；
（4）用于诱导的细胞须处于对数生长期、密度适中—过密或过疏的细胞分化效率都会下降。
5.形态与污染判断
（1）正常：圆形、淋巴母细胞样，呈松散团块悬浮，折光性好；偶有少量贴壁细胞属正常；
（2）异常：细胞变小、碎片增多、团块致密—多为密度过高或血清问题；
（3）异常：培养基浑浊、pH骤降—提示污染，须立即隔离处理。
6.代次与质控
（1）连续传代后生长速率与分化响应可能漂移，建议冻存低代次种子并固定实验代次窗口；
（2）建议定期STR/同工酶鉴定与支原体检测；悬浮细胞支原体污染发展更快，检测频率应高于贴壁细胞。
