HEK-293为人胚胎肾细胞，由人胚胎肾组织经5型腺病毒DNA转化获得，呈上皮样、贴壁生长，核型为亚三倍体，倍增时间约24-30小时。该细胞转染效率高、增殖迅速、培养门槛低，广泛用于外源基因表达、重组蛋白制备、病毒包装（如：AAV、慢病毒、腺病毒）、膜蛋白与离子通道功能探究、药物筛选及高通量检测，是分子生物学研究中经典的人源细胞模型。HEK-293代谢旺盛、易聚团，培养过程中需严格控制传代密度与消化终止时机，本文将针对HEK-293细胞培养流程进行梳理。
一、细胞复苏
1.【准备工作】配制完全培养基：MEM改良Eagle培养基（abs9467-500ml/SV30308.01）+ 10% FBS（abs972-500mL/SV30302.03）+1%P/S（abs9244-100ml/SV30010）,取9mL于37℃预热。水浴锅预热至37℃；生物安全柜紫外照射30min。建议将装有完全培养基的培养瓶提前放入培养箱15min以上，使pH稳定在7.0-7.6后再接种，避免培养基偏碱。
2.【融化】从液氮取出冻存管，37℃水浴轻柔摇晃融化，约2min；融化期间保持管盖与O型圈在水面之上，减少污染风险。
3.【重悬】内容物融化后立即取出，70%乙醇擦拭或浸洗消毒外壁，此后全程严格无菌操作；将细胞悬液转入含9mL完全培养基的离心管中。
4.【离心】约125×g离心5-7min，弃上清，去除DMSO残留。
5.【重悬】加入1-2mL完全培养基轻轻吹打重悬；接种T25培养瓶（加入5-6mL完全培养基），十字混匀，标注名称、代次、日期。
6.【培养】放入37℃、5%CO₂培养箱静置培养,复苏后24h换液。
注意：HEK-293成团倾向明显，复苏后镜下见小团块属于正常现象，传代吹打充分即可分散，不必因此怀疑细胞状态。
二、细胞传代
1.【实验准备】配制完全培养基：MEM改良Eagle培养基（abs9467-500ml/SV30308.01）+ 10% FBS（abs972-500mL/SV30302.03）+1%P/S（abs9244-100ml/SV30010）。提前取出D-PBS（abs971-500ml/SH30028.02）与0.25%胰酶-EDTA（abs47047375-100mL/SH30042.01），恢复至室温；生物安全柜紫外照射30min。以下体积以T75瓶为准，其他规格按比例增减。
2.【镜检】汇合度达70%-90%时传代；细胞呈上皮样、多边形，镶嵌排列；倍增时间约24-30小时，通常2-3天需要传代一轮。维持细胞密度在2×10⁴-3.2×10⁵个/cm²之间。
3.【细胞清洗】吸弃旧培养基，用D-PBS（abs971-500ml/SH30028.02）轻轻润洗细胞层1次，去除残留血清；沿瓶壁加入，避免直接冲刷细胞面。
4.【细胞消化】加入2-3mL胰酶-EDTA（abs47047375-100mL/SH30042.01）溶液覆盖瓶底，室温或37℃静置，镜下观察至细胞层分散，通常3-7min（该细胞消化较快，注意观察）。
注意：等待细胞脱落期间切勿敲击或摇晃培养瓶；HEK-293本就易成团，敲瓶会让团块更大，转染铺板的均匀度随之变差。
5.【终止与收集】加入6-8mL完全培养基终止消化，轻轻吹打使细胞脱落并分散为单细胞悬液（成团明显时可静置1-2min待大团自然沉降后再吸取上层单细胞悬液）。
6.【离心】1000rpm离心5min，弃上清；加入完全培养基轻轻重悬。
7.【传代】按1:6-1:10的比例接种至新瓶（推荐接种密度2×10³-6×10³个/cm²），补加完全培养基至工作体积，十字混匀，标注信息。
8.【镜检】镜下确认分散均匀后放入37℃、5%CO₂培养箱；换液每2-3天一次。
注意：HEK-293常有部分细胞脱落悬浮，换液或传代时须将悬浮细胞一并离心收集、与贴壁细胞合并，否则每代都在损失细胞。
三、细胞冻存
1.【准备工作】冻存液：完全培养基+5%（v/v）DMSO（abs9187-100mL）；如使用无血清细胞冻存液（abs9417-100mL）可省去程序降温步骤。冻存管标注名称、代次、冻存人、日期；安全柜紫外照射30min。
2.【细胞收集】取对数生长期、汇合度70%-90%的细胞，按传代步骤消化收集，离心后弃上清。
3.【细胞重悬】加入冻存液（约1mL/管）轻柔吹打重悬，细胞密度约2-5×10⁶/mL。
4.【冻存】每管1mL入冻存盒，-80℃过夜后转移至液氮气相长期保存。注意：-70℃存放会导致活力丧失，不可长期置于-80℃。
四、关键注意事项
1.培养基与血清
（1）标准配方为EMEM+10% FBS；DMEM高糖（abs9483-500ml/SV30303.01）替代亦可良好生长，为国内常用替代方案；
（2）HEK-293代谢旺盛，切勿让培养基长时间变黄—过酸环境会降低转染效率并增加细胞应激；
（3）建议固定批号并使用优级胎牛血清（abs972-500mL/SV30302.03）。
2.成团与分散（该细胞的核心问题）
（1）HEK-293钙黏蛋白介导的细胞间黏附强，天然易成团；消化充分、吹打轻柔充分是控制成团的关键；
（2）转染或流式实验需要单细胞悬液时，可适当延长消化至细胞完全分散，或使用含EDTA的消化液；
（3）离心力不宜过大，150-300×g即可，离心过猛会加剧团块；
（4）轻度成团不影响生长与转染；若团块巨大且持续增多，需排查消化终点、血清与细胞代次。
3.传代密度与节奏
（1）生长快、产酸快，推荐按1:6-1:10传代，每2-3天传代或换液一轮；
（2）推荐接种密度2×10³-6×10³个/cm²；转染实验前一天铺板，使转染时汇合度达60%-80%；
（3）该细胞是病毒包装（AAV/慢病毒/腺病毒）的通用底盘，包装实验建议使用低代次细胞并控制汇合度。
4.形态与污染判断
（1）正常：上皮样、多边形、镶嵌排列；可见小团块与少量悬浮细胞，属正常；
（2）异常：大团块增多且不铺展、碎片增加——多为消化不当或代次过高；
（3）异常：培养基浑浊、pH骤降——提示污染，须立即隔离处理。
5.生物安全
（1）该细胞经5型腺病毒DNA转化，核型为亚三倍体，属BSL-2管理范畴，须在生物安全柜内操作；
（2）用于病毒包装时，遵守本机构对重组病毒操作的相应生物安全规定；该细胞在裸鼠体内有致瘤性，废弃物按规范灭活处理。
6.代次与质控
（1）HEK-293衍生系众多（293T、293FT、AAV-293、293F悬浮等），订购与实验记录务必写全名称，不同衍生系的培养细节存在差异；
（2）建议定期STR鉴定与支原体检测—该细胞常用于病毒包装与蛋白生产，支原体阳性后果严重；
（3）连续传代后转染效率可能下降，关键实验使用低代次细胞。
参考资料
ATCC
