靶向FOXM1占位精准调控细胞增殖与信号通路的关键化学探针FDI-6介绍

▲FDI-6 (T4005，CAS: 313380-27-7 ）的化学结构式

FDI-6 (T4005)，CAS: 313380-27-7 是一种直接作用于转录因子FOXM1并抑制其与DNA结合的小分子化学探针。其作用机制为与FOXM1蛋白结合，阻断FOXM1叉头结构域对特异序列的占位，从而选择性下调FOXM1激活的基因。鉴于FOXM1主导细胞周期推进、DNA复制与有丝分裂的关键转录程序——涵盖细胞周期蛋白（如CCNB1）、检查点磷酸酶（如CDC25B）、有丝分裂激酶（如PLK1、AURKB）以及动粒/纺锤体组分（如CENP-F）——FDI-6 通过解除FOXM1-DNA复合体，直接干预DNA/RNA合成轴上以FOXM1为核心的增殖型转录网络[1,2]。

在信号通路层面，FOXM1整合促分裂信号与细胞周期激酶输入，放大G1/S进入、S期复制能力及G2/M执行所需基因的转录。CDK及有丝分裂激酶的磷酸化调控其转录活性，促进其在靶启动子/增强子上招募协同激活因子与RNA聚合酶II。FDI-6 通过阻断末端的DNA占位步骤，使FOXM1与这些上游激酶信号及共激活复合物的功能耦联被切断，进而抑制RNA聚合酶II的有效募集与FOXM1靶基因的转录输出。由此，FDI-6 作为DNA/RNA合成通路中的“节点型”调节因子，并非普遍压制转录机器，而是特异限制依赖FOXM1占位的转录事件。

在生物学功能研究中，FDI-6 对FOXM1激活基因的选择性抑制，适用于时序解析FOXM1在S期进入、复制起始许可、染色体分离能力与检查点稳健性中的依赖性。结合细胞周期同步，FDI-6 可用于区分FOXM1-DNA占位丧失的直接转录后果（可通过新生转录测序快速捕获）与后续间接效应；并可联用FOXM1与染色标记的ChIP-seq，界定真正依赖占位的直效靶基因。作为工具化合物，FDI-6 适合于：(i) 通过短时处理结合RNA-seq或PRO-seq界定FOXM1核心转录程序；(ii) 与CDK或PLK1抑制剂联合，解析FOXM1与细胞周期激酶间的顺序与表型外显关系；(iii) 在复制应激框架下，通过起始点点火与复制叉动力学读出，评估急性FOXM1阻断的耦联效应；(iv) 作为化学学术手段补充基因学敲低/敲除，分辨立即性DNA占位需求与长期适应性改变。在FOXM1活性高的模型中，FDI-6 可量化由FOXM1占位直接驱动的增殖/有丝分裂基因表达比例，为调控网络推断与通路生物标志物基准化提供依据[1,2]。

■ 2. 文献分享
■ 2.1 Mechanistic Insights into the FOXM1/BUB1 axis-Mediated Oncogenic Signaling in Hepatocellular Carcinoma.

▲  BUB1敲低增强HUH7细胞对FOXM1抑制剂FDI-6的敏感性。（A）BUB1 shRNA对FDI-6抑制克隆形成的影响；（B）BUB1 shRNA对FDI-6诱导凋亡的影响；（C）BUB1 shRNA对FDI-6诱导DNA损伤的影响；（D）BUB1 shRNA对FDI-6所致G2/M期阻滞的影响；（E–F）Western blot检测BUB1 shRNA与FDI-6对DNA修复及细胞周期相关基因表达的影响；（G–H）免疫荧光及Western blot检测BUB1 shRNA与FDI-6对干性标志物（CD44、CD133、SOX2、OCT4、BMI1、HMGA1）表达的影响；（I–J）BUB1 shRNA对FDI-6抑制细胞侵袭迁移及EMT相关基因（CDH2、VIM、CTNNB1、CDH1）表达的影响；（K–P）各组HUH7移植瘤小鼠体重、肿瘤体积、肿瘤重量及抑制率统计，以及Ki-67和FOXM1免疫组化染色。结果显示BUB1敲低显著增强FDI-6的抗肿瘤效应。数据以mean±SEM表示，单因素ANOVA，P<0.05，P<0.01 vs. NC KD组；P<0.05，P<0.01 vs. BUB1 KD+FDI-6组。

FDI-6 (T4005) 被明确为FOXM1抑制剂。在HUH7肝细胞癌模型中，BUB1敲低显著增强了FDI-6对克隆形成的抑制，并促进FDI-6诱导的细胞凋亡，同时进一步提升FDI-6对DNA损伤的促进作用。BUB1 shRNA与FDI-6联合使细胞周期在S期与G2/M期阻滞，且BUB1敲低放大了FDI-6对CDK1、CCNB1、XRCC2、BRCA1与Rad51等细胞周期与DNA修复相关蛋白的调控。FDI-6单独即可显著下调CD44、CD133、SOX2、OCT4、BMI1、HMGA1等干性标志，FOXM1敲低进一步增强了这种抑制，且与BUB1敲低联合可降低细胞侵袭与迁移。FDI-6还下调CDH2、VIM、CTNNB1并上调CDH1等EMT相关基因。在体内，20 mg/kg FDI-6显著降低HUH7移植瘤体积与重量，联合BUB1敲低后肿瘤体积抑制率提升至51.13%，且Ki-67水平更低。药理共靶向方面，BUB1抑制剂BAY与FDI-6在1:0.25–1:1.5比例范围内对增殖表现出协同抑制，在1:1比例显著抑制克隆形成，并明显提高凋亡率（各0.5 μM时至32.74%，各1.0 μM时至50.6%）。在移植瘤中，20 mg/kg FDI-6降低肿瘤负荷，顺序给药（先FDI-6后BAY）进一步抑制增殖，肿瘤体积抑制率达57.58%。机制上，FDI-6与BAY协同促进DNA损伤，更强抑制同源重组修复基因，协同造成G2/M阻滞并更显著调控ATR/CHK1/CDC25C/CDK1/CCNB1，抑制干性标志与球形体形成，并协同抑制迁移侵袭且更强调控EMT基因。[3]

■ 2.2 Endothelial FOXM1 and Dab2 promote diabetic wound healing.

▲  FOXM1抑制剂FDI-6下调Dab2表达及VEGFA诱导的VEGFR2磷酸化。（A）皮肤内皮细胞经FDI-6处理后Dab2与VEGFR2免疫荧光代表性图像，标尺=50 μm；（B）FDI-6抑制Dab2表达的机制示意图；（C）A图中免疫荧光强度的定量分析（n=3，mean±SD，t检验）；（D）Western blot检测常糖或高糖条件下VEGFA诱导的VEGFR2近端信号通路磷酸化水平；（E）D图的定量分析（n=3，mean±SD，单因素ANOVA）；（F）Western blot检测FDI-6对VEGFA诱导的VEGFR2近端信号通路磷酸化的影响；（G）F图的定量分析（n=3，mean±SD，单因素ANOVA）。结果显示FDI-6显著降低Dab2表达及VEGFR2、ERK、AKT的磷酸化水平。

FDI-6 (T4005) 被明确为可阻断FOXM1与DNA结合的FOXM1转录激活抑制剂，并在本研究中用于在原代内皮细胞中特异性抑制FOXM1功能。在FDI-6处理条件下，免疫荧光分析显示磷酸化VEGFR2与Dab2的表达显著下降，相较对照组出现明确降低。与之相一致的蛋白水平检测结果表明，FDI-6进一步降低了磷酸化VEGFR2的蛋白水平，并同时降低下游关键激酶ERK与AKT的活化状态，即其磷酸化水平。这些结果共同表明，应用FDI-6可在内皮细胞中同时削弱VEGFR2的磷酸化、降低Dab2的表达，并抑制ERK与AKT的磷酸化，呈现出对经典VEGF信号通路的整体性下调效应。由此，FDI-6不仅可作为化学探针用于解析FOXM1对Dab2及VEGFR2级联反应的调控关系，也显示出其在同一实验体系内对受体与下游效应分子多层级节律的同步抑制特征，从受体层面的磷酸化到下游关键激酶的活化均表现为一致的下降。[4]

■ 2.3 A drug repurposing study identifies novel FOXM1 inhibitors with in vitro activity against breast cancer cells.

▲ 候选药物与FDI-6在FOXM1-DBD活性位点内的比较性对接构象。（a）所有筛选药物（Pantoprazole蓝色、Silibinin红色、Famotidine黄色、Rabeprazole橙色）与FDI-6（绿色）在FOXM1-DBD活性位点中的对接构象叠加；（b-e）Famotidine、Silibinin、Rabeprazole和Pantoprazole分别与FDI-6在FOXM1-DBD活性位点中的个体构象比较。图中展示了各化合物与关键氨基酸残基His287、Asn283、Arg286等的相互作用模式。

FDI-6 (T4005) 在本研究的体外计算分析中作为阳性对照用于评估与FOXM1 DNA结合域的相互作用。研究对多种候选分子与FOXM1-DBD活性位点的结合进行了分析，并与FDI-6进行比较。分子对接结果显示，FDI-6可通过疏水作用和常规氢键与His287、Asn283、Arg286及Trp308等位点发生相互作用。进一步的相互作用分析指出，作为标准抑制剂的FDI-6在活性位点与His287、Asn283和Arg286这三个关键氨基酸形成两条常规氢键。研究还给出了与其他化合物的比较性对接构象，其中包含位于FOXM1-DBD活性位点内的FDI-6，以便进行直接构象对比。分子动力学模拟方面，FOXM1-DBD–FDI-6复合物的平均RMSD约为3.70 Å，提示在模拟过程中相对于初始构象存在中等程度的结构偏移。这些结果共同刻画了FDI-6与FOXM1-DBD的残基层面相互作用特征，明确了其在活性位点与关键氨基酸的氢键网络，并通过模拟给出了复合物的动态稳定性指标，从而在该计算研究框架中将FDI-6确定为评估FOXM1-DBD结合的基准配体。[5]

■ 2.4 FDI-6 inhibits VEGF-B expression in metastatic breast cancer: a combined in vitro and in silico study.

▲  FDI-6（8 µM）对HUVEC及MDA-MB-231细胞伤口愈合能力的影响。（A）FDI-6处理的HUVEC细胞在24 h及48 h时伤口闭合率显著低于对照组；（B）FDI-6处理的MDA-MB-231细胞在24 h及48 h时伤口闭合率显著低于对照组。结果表明FDI-6可显著抑制两种细胞的迁移能力。数据以mean±SEM表示，Student's t检验，p < 0.05，p < 0.01，p < 0.001，p < 0.0001。

FDI-6 (T4005) 在细胞与计算研究中表现出多项作用。在内皮来源的HUVEC细胞中，FDI-6 降低细胞活性，24小时与48小时的IC50分别为24.2 µM与22.1 µM。在恶性MDA-MB-231细胞中，FDI-6 的抑制更为显著，24小时与48小时的IC50分别为10.8 µM与12.5 µM，并且除48小时的4 µM外，在多数浓度与时间点均显著降低细胞活性。在迁移相关实验中，MDA-MB-231与HUVEC被给予8 µM FDI-6并监测伤口闭合进程；其中MDA-MB-231在24与48小时均出现显著的伤口闭合增加。分子对接结果显示，FDI-6 以−10.8 kcal/mol的结合亲和力与VEGFR1结合，并与Glu878、Cys1018、Ile1038和Asp1040形成氢键，其结合模式与一类VEGFR1内参抑制剂相似，且略高的打分支持其具有抑制VEGFR1的潜力。200 ns分子动力学模拟进一步显示VEGFR1/FDI-6复合物稳定，蛋白在200 ns后保持稳定，且FDI-6 在蛋白腔体内未见低于2 nm的去稳定化行为。上述结果共同表明，FDI-6 在内皮与肿瘤细胞中降低活性，在特定条件下影响MDA-MB-231的伤口闭合，并与VEGFR1形成稳定而强的相互作用。[6]

■ 3. 结语
FDI-6 通过直接结合转录因子FOXM1，选择性抑制其叉头DNA结合结构域，阻断FOXM1与特异DNA序列的结合，从而下调FOXM1激活的关键细胞周期、DNA复制及有丝分裂相关基因。文献报道显示，FDI-6有效抑制增殖基因表达，诱导细胞周期阻滞和凋亡，调控EMT与干性标志物，削弱VEGFR2信号通路活性。在肝细胞癌模型中，FDI-6与BUB1抑制剂协同发挥抗肿瘤作用，同时在肝纤维化和糖尿病伤口愈合等病理过程中展现潜力。未来研究可进一步开发FDI-6在肿瘤及纤维化疾病中的治疗应用，深入解析其与FOXM1及相关激酶的分子互作，并拓展其作为化学生物学工具在转录调控和通路生物标志物鉴定中的应用。

■ 4. Q&A
Q1: FDI-6抑制FOXM1活性的主要机制是什么？
A1: FDI-6通过直接与FOXM1结合，阻断其叉头DNA结合结构域与特异DNA序列的结合，从而选择性下调FOXM1激活的基因转录。

Q2: FDI-6如何影响癌细胞增殖？有哪些证据支持其与其他抑制剂的协同作用？
A2: FDI-6抑制增殖相关基因表达，诱导S期及G2/M期细胞周期阻滞，促进细胞凋亡，并降低干性及EMT标志。文献显示，FDI-6与BUB1抑制剂联合使用在肝细胞癌模型中协同抑制肿瘤生长，增强DNA损伤并更强调控细胞周期及修复蛋白。

Q3: FDI-6在非癌症生物学过程中有哪些调控作用？
A3: FDI-6在内皮细胞中抑制VEGFR2磷酸化和Dab2表达，调节糖尿病伤口愈合；同时在肝纤维化模型中，FDI-6减少FOXM1与MAT复合物形成，降低纤维化及炎症相关标志物。

■ 5. 参考文献
[1] Laoukili J, Kooistra MRH, et al. FoxM1 is required for mitotic entry and cell cycle progression. Nat Cell Biol. 2005;7(2):126-136.
[2] Gormally MV, Dexheimer TS, et al. Suppression of the FOXM1 transcriptional program by the small-molecule DNA-binding inhibitor FDI-6. Nat Commun. 2014;5:5165.
[3] Wang S, Mao Y, Zeng T, Yong T, An Y, Li J, et al.. Mechanistic Insights into the FOXM1/BUB1 axis-Mediated Oncogenic Signaling in Hepatocellular Carcinoma.. International journal of biological sciences. 2026;22(6):2986-3012.
[4] Bhattacharjee S, Gao J, Lu Y, Eisa-Beygi S, Wu H, Li K, et al.. Endothelial FOXM1 and Dab2 promote diabetic wound healing.. JCI insight. 2025;10(2):.
[5] Abusharkh KAN, Comert Onder F, Çınar V, Hamurcu Z, Ozpolat B, Ay M. A drug repurposing study identifies novel FOXM1 inhibitors with in vitro activity against breast cancer cells. Med Oncol. 2024 Jun 25;41(8):188.
[6] Duzgun Z, Korkmaz FD, Akgün E. FDI-6 inhibits VEGF-B expression in metastatic breast cancer: a combined in vitro and in silico study. Mol Divers. 2025 Apr;29(2):1069-1078.