细胞通讯分析揭示胶质母细胞瘤微环境中小胶质细胞的异质性表型状态
期刊：Genome Medicine
影响因子：10.8（2024）
主要技术：单细胞RNA测序（scRNA-seq）、空间转录组学、多色流式细胞术、免疫组化/免疫荧光、CellChat细胞间通讯分析
科学问题
胶质母细胞瘤（GBM）相关髓系细胞——包括脑内驻留的小胶质细胞与外周单核细胞来源的巨噬细胞——在患者肿瘤中是否具有表型与功能的异质性？这种由GBM"教育"产生的肿瘤微环境（TME）异质性能否在患者来源原位异种移植瘤（PDOX）模型中复现？GBM肿瘤细胞如何通过细胞间通讯重塑免疫微环境并影响治疗反应？
技术路线
实验材料和方法
患者来源模型：来自35例胶质瘤患者的46个PDOX模型（42例IDH野生型GBM、4例IDH突变型高级别星形细胞瘤；含4对初诊/复发纵向模型，39个模型完成遗传与甲基化表征）。
对照模型：GL261小鼠胶质瘤同系原位模型（C57BL6/N品系，早/中/晚3个时间点）及两种品系正常脑对照（nude脑1,692细胞、BL6/N脑1,972细胞）。
患者样本：GBmap数据库240例患者肿瘤（其中103例含足够髓系细胞分析）、Darmanis等4例IDHwt GBM单细胞数据、16例患者肿瘤空间转录组（16位患者）、IVY-GAP bulk RNA-seq（279个片段/44例肿瘤）、CGGA 263例IDHwt GBM生存队列。
技术方法：Drop-seq单细胞RNA测序（PDOX小鼠TME）、空间转录组学（RCTD细胞类型去卷积）、多色流式细胞术、免疫组化/免疫荧光、Boyden小室迁移实验、pHrodo Red吞噬实验、SCENIC基因调控网络、CellChat（v1.6.0，CellChatDB.mouse）细胞间通讯推断。
药物处理：替莫唑胺（TMZ）40 mg/kg口服灌胃（约合人体120 mg/m²），每周5次共8剂，MRI监测肿瘤生长。
导语
《Genome Medicine》发表胶质母细胞瘤微环境重磅研究！卢森堡健康研究所联合多国团队，通过跨物种单细胞测序与细胞通讯分析，首次在患者来源原位异种移植瘤（PDOX）模型中系统解码了GBM"教育"免疫微环境的完整图景。研究发现：脑内驻留的小胶质细胞是GBM髓系微环境的主力，并在不同肿瘤生态位中转变为包含吞噬和树突状细胞样特征的多种异质性表型状态；替莫唑胺（TMZ）化疗还会重塑肿瘤与微环境之间的细胞通讯网络。这项研究不仅揭示了GBM免疫逃逸的新机制，更为优化临床前模型和靶向髓系细胞的免疫治疗策略提供了全新视角。
主要技术
单细胞RNA测序（scRNA-seq）、空间转录组学、多色流式细胞术、免疫组化/免疫荧光、CellChat细胞间通讯分析
研究结果
1.PDOX原位移植后人源TME成分耗竭，小鼠来源细胞重建GBM微环境
为系统评估临床前模型对肿瘤微环境（TME）的复现能力，作者将患者来源类器官颅内原位移植，构建了覆盖35例胶质瘤患者的46个PDOX模型。流式细胞术证实：人源CD31⁺内皮细胞与CD45⁺免疫细胞在首代移植后即被耗竭，由小鼠同源细胞取而代之（图1C）。随后对9个代表性PDOX模型进行单细胞RNA测序，共获得21,522个细胞、24,067个基因，无监督聚类识别出9大类TME细胞群，包括星形胶质细胞、内皮细胞、室管膜细胞、周细胞、少突胶质细胞、少突胶质前体细胞及免疫细胞（图1D）。与患者一致，髓系细胞是PDOX和GL261模型中最主要的免疫成分；T淋巴细胞大幅耗竭，GL261中浸润淋巴细胞以T/NK细胞为主并随肿瘤进展升高（3.3%–13.5%）。值得注意的是，不同PDOX的TME构成呈现患者特异性趋势：如LIH0192来源模型髓系细胞比例高，而LIH0347来源模型星形胶质细胞丰富，提示肿瘤细胞的遗传背景会影响TME组成。
图1 GBM PDOX中小鼠来源TME的组成
2.TME各亚群发生GBM特异性转录适应
为检验小鼠TME细胞是否被人GBM细胞影响，作者将PDOX各细胞群与对应正常脑比较，发现所有TME亚群均发生显著转录改变，且变化幅度整体强于GL261模型，表明人GBM细胞与小鼠来源TME之间存在有效的跨物种串扰。转录适应最突出的是髓系细胞、内皮细胞、星形胶质细胞和OPC（图2A、2B）。髓系细胞激活了迁移、炎症和细胞因子产生相关程序，同时下调P2ry12、Tmem119、Gpr34等稳态标志基因，并上调Spp1（骨桥蛋白）、Fn1、Cst7、Ch25h等GBM特异性TAM标志，提示其向肿瘤相关巨噬细胞（TAM）转变（图2B、2C）。OPC激活了组织炎症与再生程序（Pdgfra、Cspg4、Cacng4），星形胶质细胞上调Gfap、Vim并下调Slc1a2、Slc1a3（反应性胶质增生），内皮细胞呈活化增殖的血管生成表型。这些适应性特征在患者GBM的相应TME亚群中同样可检出（图2D），证明PDOX能够重现GBM特异的TME转录适应。
图2 PDOX中GBM影响TME亚群的转录适应
3.GBM教育的小胶质细胞主要源于脑内驻留小胶质细胞
Iba1染色显示，正常脑中小胶质细胞呈分支状"监视"形态，而PDOX肿瘤内TAM呈阿米巴样或过度分支形态；侵袭性肿瘤边缘呈现从分支状向阿米巴样过渡的形态梯度，且随肿瘤生长、肿瘤细胞密度增加，阿米巴样细胞增多（图3A、3B）。为解析髓系细胞起源，作者将PDOX髓系细胞参考映射至Ochocka等数据集，结果显示：PDOX肿瘤微环境中脑内驻留小胶质细胞（Mg）占81%–100%，外周单核来源细胞（Mo）仅占0%–19%，边缘相关巨噬细胞（BAM）占0%–8%；血管生成型P13模型中Mo和BAM比例相对升高（7%和5%）。相比之下，GL261肿瘤含明显更多的Mo（图3C、3D）。流式细胞术进一步证实PDOX的TME中以Mg为主导（图3E），提示外周免疫细胞在PDOX中的浸润极低，且仅限于血脑屏障严重破坏的肿瘤区域。
图3 GBM教育髓系细胞的起源解析
4.小胶质细胞来源的TAM呈现9种异质性转录表型状态
作者对PDOX、GL261与正常脑的髓系细胞进行无参考聚类，鉴定出9个表型状态：CL0–CL6为小胶质细胞（其中CL0–CL1为稳态小胶质细胞Ho-Mg，CL2–CL6为小胶质细胞来源的肿瘤相关巨噬细胞Mg-TAM），CL7为单核来源细胞（Mo），CL8为边缘相关巨噬细胞（BAM）（图4A–C）。经典型促肿瘤Mg-TAM（CL2/CL3）高表达Spp1、Cst7、Cxcl13、Apoe等基因，其中CL3的细胞因子（Ccl3、Ccl4）表达更高，分泌特征更强；此外还鉴定出星形胶质细胞样（CL4，Sparcl1、Gfap）、内皮样（CL5，Pecam1、Cldn5）以及细胞周期型（CL6）Mg-TAM（图4C）。流式证实CD45high、CCR2⁺的激活态小胶质细胞在肿瘤核心富集（图4D）。TSCAN轨迹分析显示细胞从Ho-Mg经CL2向Mg-TAM整体转变；SCENIC调控网络分析表明，CL3 Mg-TAM受Hif1a、Stat1、Mafb、Irf8等转录因子调控，提示缺氧参与促肿瘤状态的转变；CL4富集Thra、Sox9、Sox2等星形胶质样调控子，CL6富集经典细胞周期调控子（图4E）。
图4 GBM驱动稳态小胶质细胞向异质性Mg-TAM转化
5.Mg-TAM呈现趋化、吞噬与树突状细胞样的免疫反应特
为解析这些表型状态的功能属性，作者对迁移、sensome（危险感知）、吞噬和抗原呈递四类基因进行了系统评估（图5A）。结果显示：从Ho-Mg向Mg-TAM转变过程中迁移签名升高（Fn1、Cxcl13、Ccl3等），Boyden小室实验证实PDOX来源的CD11b⁺髓系细胞迁移能力显著增强（图5B）。sensome在CL0、CL2和CL3中最高，由Cd74、Cd52、Cxcl16、Clec7a等驱动，而经典稳态基因下调。CL3 Mg-TAM同时上调吞噬相关基因（Trem2、Tyrobp、Axl）和抗原呈递相关基因（Itgax/CD11c、Igf1、Cd86、MHC-II），与Mo相似但不同于BAM（图5A）。pHrodo吞噬实验显示，CL3比例最高的PDOX P8其CD11b⁺细胞吞噬能力显著增强，且吞噬主要发生于CD45high的Mg-TAM（图5C–F）；CD11c、CD86和MHC-II蛋白水平在肿瘤核心的小胶质细胞中明显激活（图5G–J）。这些细胞不表达经典树突状细胞标志，排除了真性DC污染；同时上调PD-L1（Cd274）、TIM-3（Havcr2）、PD-1及CD47/SIRPα"别吃我"信号，提示其在促肿瘤与抗肿瘤功能间的精细平衡。
图5 GBM教育小胶质细胞的功能特征
6.异质性小胶质细胞状态在患者GBM中重现并呈空间生态位分布
为检验PDOX发现的临床相关性，作者在GBmap数据库240例患者肿瘤（103例含髓系细胞分析）中提取髓系细胞，确认小胶质细胞（Mg）是患者GBM的主要髓系成分；PDOX中定义的各表型状态在患者Mg/Mo中稳健复现，Mg与Mo均向TAM汇聚（图6A、6B）。基于IVY-GAP bulk RNA-seq（279个肿瘤片段）的分析显示，Mg富集于浸润区和细胞性肿瘤，而Mo/BAM签名在血脑屏障渗漏相关生态位（增生血管、微血管增殖、假栅栏样坏死区）尤其突出（图6C）。16例患者肿瘤的空间转录组进一步证实：Mg富集于浸润区和细胞性肿瘤，Mo富集于假栅栏样与血管增殖区；空间加权相关分析显示，CL0–CL1稳态Mg、CL2–CL3 Mg-TAM、Mo和BAM的签名与sensome、吞噬、抗原呈递功能签名共定位（图6D、6E）。其中CL3 Mg-TAM与间充质样（MES）GBM状态共同富集于"反应性免疫"生态位，而Mo与"反应性缺氧"生态位相关。生存分析显示，经典型GBM中CL2/CL3 Mg-TAM评分高的患者生存期更短，凸显其预后价值。
图6 人GBM中髓系细胞的转录状态与空间分布
7.TMZ治疗重塑GBM细胞与微环境的转录适应和细胞间通讯
最后，作者在MGMT启动子甲基化的P3 PDOX模型中给予临床相关剂量替莫唑胺（TMZ，40 mg/kg，共8剂），MRI证实TMZ显著抑制肿瘤生长（图7A、7B）。单细胞分析显示，TMZ后存活肿瘤细胞激活p53相关信号、凋亡/细胞死亡等抗性机制，间充质样（MES）亚型比例升高（图7C）；TME中髓系细胞比例增加，肿瘤核心Iba1⁺细胞增多，髓系细胞上调炎症、迁移、趋化与胶质生成相关基因（图7D–G）。CellChat细胞间通讯分析显示，TMZ处理后推断的配体-受体相互作用数量从236个增至425个，互作强度从5.717增至6.415（图7H、7I）。髓系细胞中Galectin信号（Lgals9–CD44/Ptprc）、Gas6–Mertk/Tyro3/Axl"吃我"通路以及App–Cd74轴等在肿瘤细胞、髓系、内皮和室管膜细胞之间发生重塑（图7J、7K），提示化疗不仅改变肿瘤细胞自身，更系统性地重编程了整个GBM生态系统的分子对话。
图7 TMZ处理后GBM细胞与TME的转录适应及细胞通讯变化
结语
这项研究首次在患者来源原位异种移植瘤（PDOX）模型中系统解析了胶质母细胞瘤（GBM）教育下肿瘤微环境的转录适应，证明脑内驻留的小胶质细胞是GBM髓系微环境的核心成分，并在不同肿瘤生态位中向具有吞噬和树突状细胞样特征的异质性表型状态转变；同时揭示替莫唑胺（TMZ）治疗会重塑肿瘤细胞与微环境的转录状态及细胞间通讯网络（如Gas6通路）。该成果不仅为理解GBM免疫微环境提供了全新范式，更凸显PDOX模型在评估治疗反应与耐药机制中的价值，为靶向髓系细胞的免疫治疗策略奠定了重要基础。
参考文献：
Yabo YA, Moreno-Sanchez PM, Pires-Afonso Y, Kaoma T, Nosirov B, Scafidi A, Ermini L, Lipsa A, Oudin A, Kyriakis D, Grzyb K, Poovathingal SK, Poli A, Muller A, Toth R, Klink B, Berchem G, Berthold C, Hertel F, Mittelbronn M, Heiland DH, Skupin A, Nazarov PV, Niclou SP, Michelucci A, Golebiewska A. Glioblastoma-instructed microglia transition to heterogeneous phenotypic states with phagocytic and dendritic cell-like features in patient tumors and patient-derived orthotopic xenografts. Genome Med. 2024 Apr 2;16(1):51. doi: 10.1186/s13073-024-01321-8. PMID: 38566128; PMCID: PMC10988817.
