ALONA ELISA定量法的具体操作流程
ALONA ELISA定量法是专门针对CAD核酸酶活性设计的亲和寡核苷酸连接实验，完整操作流程如下：
🧪 实验前准备
提前准备好链霉亲和素预包被的96孔酶标板、5'端标记地高辛、3'端标记生物素的双链DNA底物、纯化的重组CAD蛋白、待验证CAD抗体、HRP标记抗地高辛抗体、TMB显色液等试剂，所有试剂室温平衡30分钟。
1. 底物固定
每孔加入100μL 含标记DNA底物的结合缓冲液，室温孵育30分钟，让DNA底物的生物素端充分结合到板底的链霉亲和素上，完成底物固定。
2. 洗板封闭
弃去孔内液体，用PBST洗涤液洗板3次，拍干后每孔加入200μL 1% BSA封闭液，室温封闭1小时，封闭板底未结合的空白位点，消除非特异性吸附。
3. 加入反应体系
弃去封闭液，洗板2次拍干，每孔依次加入梯度稀释的重组CAD标准品、待验证CAD抗体对应的待测反应液，补充反应缓冲液补足至100μL，37℃恒温孵育30分钟，让CAD充分切割固定在板上的DNA底物。
4. 终止酶切反应
弃去孔内反应液，用含5mM EDTA的PBST洗涤液洗板5次，彻底终止CAD的核酸酶活性，洗去未结合的游离蛋白和切割产生的游离DNA片段。
5. 酶标抗体孵育
每孔加入100μL 1:5000稀释的HRP标记抗地高辛抗体，室温避光孵育30分钟，让抗体结合到未被CAD切割的DNA底物5'端地高辛标记位点上。
6. 显色读数
弃去酶标抗体液，洗板5次拍干，每孔加入100μL TMB显色液，室温避光显色10分钟，加入50μL 2M H₂SO₄终止反应，15分钟内用酶标仪在450nm波长下读取各孔OD值。
7. 结果定量
以重组CAD标准品的活性单位为横坐标，对应OD值为纵坐标绘制标准曲线，代入待测样本的OD值，即可换算出待验证CAD抗体对应的核酸酶活性定量结果。
🧪 实验前准备
提前准备好链霉亲和素预包被的96孔酶标板、5'端标记地高辛、3'端标记生物素的双链DNA底物、纯化的重组CAD蛋白、待验证CAD抗体、HRP标记抗地高辛抗体、TMB显色液等试剂，所有试剂室温平衡30分钟。
1. 底物固定
每孔加入100μL 含标记DNA底物的结合缓冲液，室温孵育30分钟，让DNA底物的生物素端充分结合到板底的链霉亲和素上，完成底物固定。
2. 洗板封闭
弃去孔内液体，用PBST洗涤液洗板3次，拍干后每孔加入200μL 1% BSA封闭液，室温封闭1小时，封闭板底未结合的空白位点，消除非特异性吸附。
3. 加入反应体系
弃去封闭液，洗板2次拍干，每孔依次加入梯度稀释的重组CAD标准品、待验证CAD抗体对应的待测反应液，补充反应缓冲液补足至100μL，37℃恒温孵育30分钟，让CAD充分切割固定在板上的DNA底物。
4. 终止酶切反应
弃去孔内反应液，用含5mM EDTA的PBST洗涤液洗板5次，彻底终止CAD的核酸酶活性，洗去未结合的游离蛋白和切割产生的游离DNA片段。
5. 酶标抗体孵育
每孔加入100μL 1:5000稀释的HRP标记抗地高辛抗体，室温避光孵育30分钟，让抗体结合到未被CAD切割的DNA底物5'端地高辛标记位点上。
6. 显色读数
弃去酶标抗体液，洗板5次拍干，每孔加入100μL TMB显色液，室温避光显色10分钟，加入50μL 2M H₂SO₄终止反应，15分钟内用酶标仪在450nm波长下读取各孔OD值。
7. 结果定量
以重组CAD标准品的活性单位为横坐标，对应OD值为纵坐标绘制标准曲线，代入待测样本的OD值，即可换算出待验证CAD抗体对应的核酸酶活性定量结果。
