单细胞免疫组库测序技术的原理、方法比较与应用策略
简述
单细胞免疫组库测序通过同时捕获T细胞受体（TCR）和B细胞受体（BCR）的全长、配对链序列，突破了传统批量测序无法解析受体异源二聚体配对信息的局限。该技术结合单细胞转录组数据，使研究者能够在单细胞水平上同时分析免疫细胞的克隆扩增状态、转录表型及抗原特异性特征，为深入理解适应性免疫应答、肿瘤微环境及疫苗反应提供了关键分析维度。一、适应性免疫识别的基础：TCR/BCR的结构与多样性来源
T细胞受体（TCR）和B细胞受体（BCR）是适应性免疫系统识别抗原的核心分子。TCR通常由α链和β链（在αβ T细胞中）或γ链和δ链（在γδ T细胞中）通过二硫键连接形成异源二聚体；BCR则由重链和轻链组成。每条链的可变区包含三个互补决定区，其中CDR3区域由V（可变）、D（多样性，仅存在于TCRβ链和BCR重链）和J（连接）基因片段的重组产生，并在连接处可随机插入非模板核苷酸，从而贡献了免疫组库的主要多样性来源。此外，B细胞在活化后还会发生体细胞高频突变和类别转换重组，进一步丰富抗体多样性。
免疫组库的多样性是机体抵御病原体的分子基础，其复杂性使得传统的批量测序难以有效解析。
二、从批量到单细胞：单细胞免疫组库测序的技术突破
传统的批量免疫组库测序方法，虽然能够从组织样本中获取整体TCR/BCR序列多样性信息，但存在两个关键局限：
（一）天然链配对信息的丢失
批量测序通常只针对单一链（如仅TCRβ链或仅IgH链）进行扩增测序，无法确定同一TCR的α链和β链（或BCR的重链和轻链）之间的天然配对关系。这一配对信息对于理解抗原识别的特异性至关重要。
批量测序通常只针对单一链（如仅TCRβ链或仅IgH链）进行扩增测序，无法确定同一TCR的α链和β链（或BCR的重链和轻链）之间的天然配对关系。这一配对信息对于理解抗原识别的特异性至关重要。
（二）无法关联转录表型与克隆身份
批量测序无法将克隆型（clonotype）与细胞的功能状态、分化亚型及其他表面标志物表达相关联，限制了研究免疫应答中细胞状态与克隆动态之间关系的深度。
批量测序无法将克隆型（clonotype）与细胞的功能状态、分化亚型及其他表面标志物表达相关联，限制了研究免疫应答中细胞状态与克隆动态之间关系的深度。
单细胞免疫组库测序技术（scTCR/BCR-seq）通过将单细胞分选与靶向扩增策略结合，有效解决了上述瓶颈。
三、主流技术平台与工作流程解析
以10x Genomics平台为例，单细胞免疫组库测序的实验流程与单细胞转录组测序共享相同的微流控核心。在凝胶微滴（GEMs）内，带有细胞条形码的引物同时捕获mRNA和经过逆转录的TCR/BCR特异性cDNA。后续构建两种独立文库：
5‘基因表达文库：捕获细胞转录组信息，用于细胞分型及状态分析。
V(D)J富集文库：通过设计于TCR/BCR恒定区（C区）的巢式引物，特异性扩增包含完整可变区的全长配对联。
该双文库设计使得同一细胞的转录组身份与其TCR/BCR序列信息可通过共享的细胞条形码直接关联。
四、单细胞免疫组库数据分析的核心策略
免疫组库测序数据的分析工作流程通常涵盖以下关键环节：
（一）数据准备与质控
从Cell Ranger V(D)J输出文件中提取filtered_contig_annotations.csv，获取每条TCR/BCR链的V、D、J基因使用及CDR3核苷酸序列信息，同步获取对应单细胞转录组表达矩阵。
从Cell Ranger V(D)J输出文件中提取filtered_contig_annotations.csv，获取每条TCR/BCR链的V、D、J基因使用及CDR3核苷酸序列信息，同步获取对应单细胞转录组表达矩阵。
（二）链配对过滤与克隆型定义
标准化链类型名称，筛选出具有完整配对链（如TRA+TRB或IGH+IGK/IGL）的有效细胞，并根据CDR3氨基酸序列的相似性（通常要求完全一致或长度及组成高度相似）将细胞归入不同克隆型，统计克隆扩增频率并绘制免疫克隆谱图。
标准化链类型名称，筛选出具有完整配对链（如TRA+TRB或IGH+IGK/IGL）的有效细胞，并根据CDR3氨基酸序列的相似性（通常要求完全一致或长度及组成高度相似）将细胞归入不同克隆型，统计克隆扩增频率并绘制免疫克隆谱图。
（三）多模态整合与高级分析
将克隆型注释信息整合至Seurat等单细胞分析对象中，在UMAP/t-SNE降维图上叠加克隆扩增状态，结合差异表达分析识别特定克隆的分子特征，并可进一步利用拟时序分析追踪克隆扩增细胞的分化路径。
将克隆型注释信息整合至Seurat等单细胞分析对象中，在UMAP/t-SNE降维图上叠加克隆扩增状态，结合差异表达分析识别特定克隆的分子特征，并可进一步利用拟时序分析追踪克隆扩增细胞的分化路径。
五、应用前景与关键挑战
该技术在多个前沿方向展现出重要应用价值：
（一）肿瘤免疫微环境分析
解析肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）中肿瘤特异性T细胞克隆的扩增程度及耗竭状态，评估免疫检查点抑制剂治疗前后的克隆动态变化。
解析肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）中肿瘤特异性T细胞克隆的扩增程度及耗竭状态，评估免疫检查点抑制剂治疗前后的克隆动态变化。
（二）感染与疫苗免疫应答监测
追踪疫苗接种或感染后抗原特异性T/B细胞克隆的扩增与持久性，评估保护性免疫的建立与维持。
追踪疫苗接种或感染后抗原特异性T/B细胞克隆的扩增与持久性，评估保护性免疫的建立与维持。
（三）自身免疫病与移植免疫
识别致病性自身反应性克隆并监测移植后供体反应性T细胞的克隆扩增，用于早期预警排斥反应。
识别致病性自身反应性克隆并监测移植后供体反应性T细胞的克隆扩增，用于早期预警排斥反应。
目前，单细胞免疫组库分析仍面临若干挑战，如测序深度不足导致低丰度克隆型丢失、注释算法的准确性与时效性取舍、以及将克隆型信息与抗原特异性直接关联的验证难度。
六、单细胞免疫组库测序(scTCR/BCR)技术服务哪里有？
乐备实可承接单细胞免疫组库测序数据分析及配套服务，基于标准化V(D)J分析流程与多组学整合方案，能够开展克隆型鉴定与注释、克隆扩增谱绘制、免疫组库多样性评估及转录组-克隆型联合分析等研究工作，为肿瘤免疫学、感染免疫与疫苗研发等领域提供高效的数据支持。
| 货号 | 产品名称 | 指标 |
|---|---|---|
| LXRBABM34-1 | AbSeq小鼠免疫发现-34Panel(必须搭配BD WTA)试剂盒 | CD31, CD326, CD45, CD3e, CD4, CD8α, CD44, CD62L, CD25, CD69, CD197, CD103, TCRγδ, CD223, CD274, CD279, CD366, TIGIT, VISTA, CD45R, CD19, CD27, CD38, CD138, CD49b, NK1.1, CD335, CD11b, I-A/I-E, Ly-6G, Ly-6G/C, F4/80, CD86, CD11c |
| AbSeq小鼠T细胞-17Panel(必须搭配BD WTA)试剂盒 | CD3e, CD4, CD8α, CD44, CD62L, CD25, CD69, CD197, CD103, TCRγδ, CD223, CD274, CD279, CD366, TIGIT, VISTA, CD45 | |
| LXRBABM25-1 | AbSeq小鼠淋巴细胞-25Panel(必须搭配BD WTA)试剂盒 | CD45, CD3e, CD4, CD8α, CD44, CD62L, CD25, CD69, CD197, CD103, TCRγδ, CD223, CD274, CD279, CD366, TIGIT, VISTA, CD45R, CD19, CD27, CD38, CD138, CD49b, NK1.1, CD335 |
