ELISpot技术的原理、工作流程、优势及应用
简述
酶联免疫斑点检测（ELISpot）将细胞培养与免疫检测原理相结合，实现了在单细胞水平对细胞因子分泌频率的直接定量分析。该技术能够从数十万个细胞中检测出单个分泌目标因子的细胞，在疫苗免疫应答评价、感染性疾病监测及肿瘤免疫研究中具有不可替代的价值。
酶联免疫斑点检测（ELISpot）将细胞培养与免疫检测原理相结合，实现了在单细胞水平对细胞因子分泌频率的直接定量分析。该技术能够从数十万个细胞中检测出单个分泌目标因子的细胞，在疫苗免疫应答评价、感染性疾病监测及肿瘤免疫研究中具有不可替代的价值。
一、ELISpot的技术原理与工作流程
（一）细胞因子原位捕获
ELISpot实验在预包被了特异性捕获抗体的PVDF微孔板中进行。将待测细胞（如外周血单核细胞或肿瘤浸润淋巴细胞）与特定刺激物（抗原肽段、丝裂原等）共孵育后，活化的细胞在局部环境中分泌细胞因子，这些因子随即被孔底紧邻的捕获抗体立即结合。
（二）免疫酶学放大与斑点形成
洗去细胞后，加入生物素标记的检测抗体（针对不同表位的二抗）形成"捕获抗体-细胞因子-检测抗体"夹心复合物。随后加入酶标记的亲和素（如碱性磷酸酶标记的链霉亲和素），在底物（如BCIP/NBT）作用下，酶催化反应在抗体结合位点附近形成不溶性紫色沉淀，最终产生一个清晰可辨的斑点。
（三）结果判读与定量
每个斑点代表一个分泌该细胞因子的细胞。通过人工计数或自动斑点分析系统，可获得每孔中阳性斑点的总数，从而计算出分泌目标细胞因子的细胞频率（如每百万细胞中阳性细胞数）。
二、ELISpot相比ELISA的核心优势
（一）功能层面的本质不同
ELISA通过显色反应测定上清液中积累的可溶性蛋白总量，反映的是"分泌了多少"；而ELISpot直接可视化单个细胞分泌行为，回答的是"有多少细胞在分泌"。这一区别在疫苗免疫应答监测中尤为重要——关键指标是抗原特异性T细胞的数量，而非每个细胞分泌的绝对量。
（二）单细胞水平的超高灵敏度
ELISpot能从20万至30万细胞中检出1个分泌特定细胞因子的细胞，这一灵敏度远高于ELISA（检测下限通常在皮摩尔级）。常规流式细胞术检测胞内细胞因子需细胞活化数小时，并可能因细胞通透处理丢失信号；ELISpot实时捕获分泌的细胞因子，更真实反映细胞功能。
（三）动态功能信息的高效获取
与仅提供转录本丰度的RNA检测技术不同，ELISpot直接测量蛋白质水平的细胞效应功能，且以单细胞频率为计量单位，为评估疫苗诱导的T细胞免疫提供了量化指标。
三、ELISpot的关键实验要点
（一）捕获抗体的选择与预包被
高质量、高亲和力、低内毒素的捕获抗体是确保特异性和低背景的基础。预包被需均匀且充分，避免边缘效应。
（二）细胞数量的优化与刺激条件
细胞接种密度的确定需保证孔底单层分布。刺激物（抗原肽、多克隆刺激剂或特异性抗原）的浓度、孵育时间和温度需根据实验目的和细胞类型进行预实验优化。
（三）斑点显色的控制与背景管理
显色反应需精确掌控时长，过度显色会导致背景升高或斑点融合。设阴性对照（无刺激物）和阳性对照（多克隆刺激剂）是监控实验条件的基本要求。
四、ELISpot的典型应用场景
（一）疫苗免疫应答评价
在艾滋病疫苗、乙肝疫苗、肿瘤疫苗等研发中，ELISpot被广泛用于检测抗原特异性T细胞频率，是评估疫苗免疫原性的核心指标之一。
（二）感染性疾病研究
ELISpot可用于结核感染诊断（T-SPOT.TB技术即基于ELISpot原理），通过检测结核特异性抗原刺激下释放IFN-γ的T细胞数量，辅助诊断潜伏性结核感染。此外，在病毒性肝炎、HIV感染等研究中，ELISpot也被用于监测特异性T细胞应答的动态变化。
（三）肿瘤免疫与细胞治疗
在肿瘤浸润淋巴细胞研究和CAR-T细胞治疗中，ELISpot用于评估效应细胞对肿瘤抗原的特异性反应强度。双色或FluoroSpot技术可同时检测同一细胞分泌的多种细胞因子（如IFN-γ和IL-2），提供更丰富的功能表型信息。
五、ELISpot检测技术服务哪个公司有？
乐备实可承接ELISpot检测及配套分析服务，基于人/小鼠多种细胞因子（IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10、TNF-α等）检测体系与标准化实验流程，可开展抗原特异性T细胞应答检测、疫苗免疫原性评价及细胞治疗产品功能性评估等研究工作，为免疫学研究与转化应用提供可靠的数据支撑。
| 货号 | 产品名称 | 指标 |
|---|---|---|
| LXREMS01-1 | IFN-γ | |
| LXEHS01-1 | IFN-γ | |
| LXEHS02-1 | IL-2 | |
| LXEMS01-1 | IFN-γ | |
| LXREHS02-1 | IL-2 |
