反应发光超分辨成像框架RIED实现细胞内细胞器约100纳米分辨率成像

超分辨荧光显微镜通过突破光学衍射极限，极大推动了对生物复杂性的理解，但其始终依赖外部光激发，这一因素深刻影响着成像能力与活细胞兼容性。反应激发发光—— 包括电化学发光、化学发光和生物发光 —— 作为一种无需光激发的替代方案，虽具备高灵敏度等优势，却因光子预算低而在时空分辨率上存在根本局限。该研究提出了一种基于化学的超分辨率成像框架 RIED，通过熵加权相关结合反卷积，实现了电化学发光、化学发光和生物发光三种模式下的细胞内细胞器超分辨率成像，分辨率达到约 100 纳米，并成功应用于表面蛋白高灵敏度成像及长达 41 小时的活细胞线粒体转移动力学连续观测。

该研究由 Wenxin Zhu、Chi Zhang、Jiahui Gui、Yibo Yang、Yuxin Wan、Xin Wang、Liying Qu、Ao Guo、Ziqing Zhang、Zhenqian Han、Weisong Zhao 及 Jiandong Feng 共同完成，文章题为 "Luminescent-reaction-enabled super-resolution imaging"，于 2026年8月在线发表于《Nature》。

重要发现
01反应发光超分辨率成像框架RIED 的构建
传统反应发光成像受限于低光子输出，单张图像往往需要数十秒的曝光时间来累积信号，不可避免地丢失了时空信息，因此超分辨率成像一直难以实现。该研究从反应发光的本质出发，指出基于反应的发光是一个高度动态的过程，intrinsically 由单个反应事件所引发。基于这一认识，研究者提出通过时空隔离策略在图像序列中实验性地监测这些反应发光过程，从而提取独特的反应驱动光子统计信息用于超分辨率重建。

RIED 技术原理

RIED 的核心工作流包含三个关键步骤。首先是时空采集，以短曝光连续记录发光信号序列，揭示零光激发背景、高信噪比以及发光反应位点与暗背景之间高对比度波动的独特发光特征。其次是时空互相关分析，对光子事件序列进行计算，排除以重叠发光体为主的像素并收窄点扩散函数宽度，同时引入空间熵图来量化局部信息含量，对相关累积量进行加权修正，以缓解电化学发光异质性带来的不连续性。最后是反卷积处理，在低光子预算条件下进一步锐化空间分辨率并提升图像对比度。研究者通过模拟数据验证了反应驱动光子统计能够为分辨率增强提供有效波动，并采用傅里叶环相关分辨率、分辨率缩放误差和分辨率缩放皮尔逊系数等指标进行逐步评估，确认 RIED 重建在有效提升分辨率的同时引入的伪影有限，且其重建性能优于原本为荧光序列开发的传统超分辨率方法。

02电化学发光超分辨率成像的实现与性能验证
在电化学发光成像方面，传统电化学发光显微镜仅能提供细胞外、全细胞或模糊的亚细胞信息，细胞内细胞器的高效电化学发光成像此前尚未实现。研究者开发了一套高效电化学发光细胞成像系统，将Ru (bpy)₃²⁺分子锚定在抗体上作为发光探针，通过免疫标记实现对细胞结构的高覆盖率特异性标记。在共反应剂的选择上，研究者采用 Bis-tris 替代常用的三丙胺，发现 Bis-tris 在优化条件下将电化学发光细胞成像亮度提升了约 1000 倍，这一提升归因于 Bis-tris 自由基固有的长寿命和扩展的扩散距离，增加了其与标记细胞器相遇并反应的概率。

RIED 在电化学发光（ECL）成像中的性能

RIED 重建流程的计算工作流与定量评估

在此基础上，微管丝即使在20 毫秒曝光时间下也能清晰可见。将 RIED 应用于电化学发光后，实现了亚衍射尺度的细胞内细胞器结构可视化。定量傅里叶环相关分辨率评估显示，电化学发光的空间分辨率达到 97 纳米，交织微管丝的峰间分离表明其分辨能力与荧光超分辨率方法相当。值得注意的是，RIED 仅需 100 帧原始帧（每帧 20 毫秒曝光）即可生成超分辨率图像，结构相似性指数大于 0.9，傅里叶环相关分辨率优于 110 纳米，展现出高时空分辨率。

RIED 与其他超分辨重建方法的对比

在三维成像方面，研究者利用电化学发光发射深度随电压增加而增大的特性，采用阶梯电压施加策略，以较低电压成像电极表面附近区域，逐步升高电压以获取更深层信息，并将电压控制与成像焦平面变化同步，构建出三维RIED 图像，可在轴向 235 纳米和横向 116 纳米间距上分辨微管。此外，RIED 的高时空分辨率还支持高通量成像，在 0.53×0.53 平方毫米的大面积区域内实现平均滚动傅里叶环相关分辨率 153 纳米的超分辨率成像。

三维 RIED‑ECL 重建与性能评估

RIED‑CL 的空间分辨率评估

03高灵敏度表面蛋白成像
电化学发光因反应在电极表面触发且不引入激发光，inherently 具有高表面灵敏度。RIED - 电化学发光能够清晰观察电极附近的微管丝，曲率分析进一步证实了这一表面敏感性 —— 在同一有丝分裂阶段，RIED 结果呈现更小的曲率值和更集中的取向分布，反映了表面附近更线性的微管特征。

基于 RIED‑ECL 的表面敏感成像

在超灵敏度生物标志物成像方面，研究者以癌胚抗原为对象评估了RIED - 电化学发光的灵敏度，将其检测阈值定义为成像生物标志物所需的最低信号。定量分析显示，尽管电化学发光效率较低，RIED - 电化学发光对癌胚抗原的检测阈值比荧光超分辨率方法降低了 8 倍，这得益于电化学发光中自发荧光的完全消除。这一结果凸显了 RIED - 电化学发光的卓越灵敏度及其为荧光超分辨率显微镜提供互补视角的能力。

04化学发光与生物发光超分辨率成像的拓展
RIED 的化学显微镜概念具有普适性，可推广至化学发光和生物发光系统。化学发光和生物发光仅需标准生物化学手段即可实现细胞内成像，无需电化学发光所需的电化学装置。研究者采用基于生物发光共振能量转移的酶催化系统，以 NanoLuc 荧光素酶为供体、mNeonGreen 荧光蛋白为受体、fluorofurimazine 为底物，在固定细胞中实现了化学发光模式下的线粒体三维分布映射，横向和轴向分辨率分别达到 102 纳米和 221 纳米，重建结果与荧光超分辨率关联成像高度一致。

RIED 实现的化学发光（CL）与生物发光（BL）超分辨成像

在活细胞生物发光演示中，研究者对微丝、内质网和微管等多种细胞器进行了成像，空间分辨率达到117 纳米，远超传统衍射极限生物发光成像。更为关键的是，生物发光消除了激光诱导的光毒性和光漂白，具备优异的生物相容性。与结构光照明显微镜对比显示，后者在连续激光照射下 18 分钟内即出现严重光漂白，而 RIED - 生物发光在相同时段内保持稳定发光状态，并可持续数小时。研究者最终实现了长达 41 小时的连续超分辨率活细胞成像，发光强度和成像对比度始终保持稳定。

RIED 与微管超分辨荧光成像的互补分析

05活细胞线粒体转移动力学的长时程追踪
利用RIED - 生物发光的长时程成像能力，研究者在 104 纳米分辨率下连续监测了活细胞中线粒体的运动。在 55×55 平方微米的视场内，对单个线粒体的平均速度、直径和数量随时间的变化进行了定量分析，发现细胞周边区域运动更快，核周区域运动较慢，且核周区域速度在小时尺度上存在波动。连续观察还发现，约 25 小时后线粒体数量开始减少，平均直径开始增大，可能反映了凋亡过程的特征。

利用 RIED‑BL 观测线粒体动力学

在线粒体转移这一细胞间通讯的重要机制研究中，传统方法难以在单线粒体水平解析转移动力学。RIED - 生物发光实现了对单个线粒体轨迹的连续超分辨率追踪，揭示了两种不同的转移模式：直接运动模式表现为相对笔直的轨迹和更高、更均匀的速度，平均均方位移扩散指数为 1.34；间接运动模式则呈现多阶段过程，包括初始稳定运动、短暂停滞和随后向受体细胞的定向运动，轨迹更具变化性，速度异质性更强，平均均方位移扩散指数为 0.96。这些观察为活细胞中单细胞器水平的线粒体转移动力学提供了定量的全过程视角。

创新与亮点
该研究突破了反应发光成像因低光子预算而无法实现超分辨率的根本难题，首次提出基于化学的RIED 超分辨率成像框架，通过时空记录、熵加权相关分析与反卷积的协同，从反应驱动光子统计中提取超分辨率信息。该技术统一适用于电化学发光、化学发光和生物发光三种模式，分辨率达到约 100 纳米，并兼具三维成像、高通量和超长时程活细胞观测能力。在光学生物医疗领域，零光激发背景赋予其极高灵敏度，使癌胚抗原检测阈值较荧光方法降低 8 倍；无激光照射则消除了光毒性与光漂白，支持 41 小时连续活细胞成像，为线粒体转移等长时程动态过程的研究提供了全新手段，在细胞生物学研究和临床生物标志物检测中具有重要应用价值。

总结与展望
该研究建立了一种化学驱动、无激光的超分辨率成像新范式RIED，在电化学发光、化学发光和生物发光三种模式下均实现了约 100 纳米分辨率的细胞内细胞器成像，并具备高灵敏度、三维、高通量及超长时程活细胞观测等独特优势。未来，反应驱动超分辨率显微镜标志着从光控激发物理向反应定制发光化学的转变，其对比度由化学反应活性驱动，intrinsically 可视化分子活性而非仅分子位置，与天然生化反应的进一步耦合有望为功能成像分析提供全新的活性视角。

论文信息
声明：本文仅用作学术目的。

Zhu, W., Zhang, C., Gui, J. et al. Luminescent-reaction-enabled super-resolution imaging. Nature (2026). 

doi:https://doi.org/10.1038/s41586-026-10889-7