近红外光声成像技术评估代谢调控生物材料在颅骨缺损修复中的应用

骨再生需要合成代谢与分解代谢信号的协同调控，但哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物1（mTORC1）与腺苷单磷酸激活蛋白激酶（AMPK）通路之间的相互作用长期未被阐明。本研究发现，柠檬酸、谷氨酰胺和镁可通过钙 / 钙调蛋白依赖性蛋白激酶 2（CaMKK2）和蛋白激酶 B（Akt）依赖性信号通路协同激活上述两条通路，绕过传统的 AMP/ATP 感知机制，从而在成骨分化过程中维持持续的能量代谢。基于此，研究者开发了一种名为 CitraBoneQMg 的柠檬酸基生物材料，通过一锅法合成整合上述活性成分，具备缓释能力、光致发光与光声成像特性以及可调控的力学性能，在大鼠颅骨缺损模型中显著加速骨再生，并促进抗炎与神经再生反应。

本研究的重要发现者为 Hui Xu、Xinyu Tan、Ethan Gerhard、Hao Zhang、Rohitraj Ray、Yuqi Wang、Sri-Rajasekhar Kothapalli、Elias B. Rizk、April D. Armstrong、Su Yan、Jian Yang，其中 Su Yan 与 Jian Yang为通讯作者。文章题为 "Metabotissugenic citrate biomaterials orchestrate bone regeneration via citrate-mediated signaling pathways"，发表于《Science Advances》。

重要发现

柠檬酸基聚合物的合成、成像特性与体内骨再生评价

基于上述机制发现，研究者通过一锅法缩聚反应，将柠檬酸、谷氨酰胺、镁与1,8 - 辛二醇合成为可生物降解光致发光聚合物（BPLP-Gln-Mg），并与羟基磷灰石（HA）复合制备骨修复材料。谷氨酰胺的引入因竞争反应位点而降低材料压缩强度，但镁的掺入可通过离子配位恢复力学性能，BPLP-0.3Gln-Mg 的压缩强度达 245.04 ± 26.12 MPa，与聚（1,8 - 辛二醇柠檬酸酯）（POC）的 260.85 ± 14.27 MPa 相当。通过调节谷氨酰胺比例可调控降解速率，BPLP-0.3Gln 在 24 周时剩余约 40% 质量，BPLP-0.5Gln 则完全降解。

免疫荧光染色代表性图像及定量统计

在光学成像特性方面，BPLP-Gln 与 BPLP-Gln-Mg 薄膜均具有内源性荧光，发射波长随激发波长变化而迁移，覆盖 310 至 700 nm 范围。BPLP-0.3Gln 的最大发射与激发波长分别为 440 nm 和 340 nm，掺入镁后分别红移至 450 nm 和 370 nm；BPLP-0.5Gln-Mg 的最大发射与激发波长则分别为 460 nm 和 370 nm。其光稳定性优于有机染料罗丹明 B 和荧光素，适合长期生物成像追踪。更重要的是，谷氨酰胺的引入赋予材料多波长光声成像能力，在 808 nm 波长下，BPLP-0.5Gln 薄膜的光声信号强度高于 BPLP-0.3Gln，镁的掺入对光声信号无显著影响。光声成像结合了光学激发与超声检测的优势，可实现更深的组织穿透、更高的空间分辨率和更好的成像对比度，为术中导航、植入物命运纵向追踪和治疗效果无创评估提供了可能。

人骨髓间充质干细胞成骨分化第 7 天的线粒体膜电位代表性图像（比例尺：50 μm）

扫描电镜（SEM）图像

体外生物学评价显示，材料可在PBS 中持续释放柠檬酸、谷氨酰胺和镁，经历初期突释后进入稳定释放阶段。在 BPLP-Gln-Mg/HA 复合支架上培养的 hBM-MSCs 呈现更厚的细胞层和更丰富的细胞外基质，钙磷比与 HA 相当，ALP 活性及 SPP1、ALPL、COL1A1 基因表达显著高于 POC/HA 对照组。免疫评价表明，该材料可诱导巨噬细胞向 M2 型极化，促进抗炎因子白细胞介素 - 10（IL-10）的释放。

体内实验采用大鼠临界尺寸颅骨缺损模型，将BPLP-0.5Gln-0.2Mg/HA（即 CitraBoneQMg）植入 5 mm 直径缺损，以 PLGA/HA 和 POC/HA 为对照。显微 CT 结果显示，术后 6 周 CitraBoneQMg 组的骨体积 / 组织体积比（BV/TV）达 31.69 ± 6.39%，12 周达 49.09 ± 9.39%，均显著高于 POC/HA 组（6 周 21.97 ± 2.52%，12 周 29.84 ± 3.09%）和 PLGA/HA 对照组（6 周 10.11 ± 1.74%，12 周 16.46 ± 1.46%）。骨矿物质密度（BMD）同样以 CitraBoneQMg 组最高，12 周达 1147.20 ± 27.95。组织学染色证实 CitraBoneQMg 组在缺损中心即有新骨形成，12 周时缺损几乎被新生骨填充。免疫组化显示 CitraBoneQMg 组 RUNX2 和骨钙素（OCN）表达更高，抗炎标志物 CD206 在术后 6 周即出现，神经再生标志物 TUBB3 在 6 周和 12 周均大量表达。材料的荧光特性还支持了体内降解追踪，12 周时 POC/HA 和 CitraBoneQMg 组仍可检测到荧光信号。

大鼠颅骨缺损模型的体内新生骨形成情况

创新与亮点

本研究突破了mTORC1 与 AMPK 通路互为拮抗的传统认知，揭示了柠檬酸、谷氨酰胺和镁通过 Akt-mTORC1 与 CaMKK2-AMPK 双轴同时激活两条通路的全新机制，其中 AMPK 的激活绕过了传统 AMP/ATP 感知机制，转而依赖钙离子介导的 CaMKK2 信号，使能量充足状态下两条通路得以协同运作。在成像技术层面，研究将谷氨酰胺引入柠檬酸基聚合物，赋予材料光致发光与光声双模成像能力，光声信号在 808 nm 近红外波长下可被检测，结合超声成像实现深部组织的高分辨率可视化，为植入物的术中定位、长期降解追踪和疗效评估提供了无创手段。在临床应用价值上，CitraBoneQMg 无需外源性生长因子或细胞，仅通过代谢调控即可促进骨、免疫和神经多组织协同再生，在大鼠颅骨缺损模型中 12 周 BV/TV 接近 50%，显著优于传统 PLGA/HA 和 POC/HA 材料，为大段骨缺损及愈合能力受损患者的修复提供了代谢优化型的生物材料设计新范式。

总结与展望

本研究确立了柠檬酸、谷氨酰胺和镁作为成骨分化多维度调控因子的核心地位，通过Akt 与 CaMKK2 分别上游激活 mTORC1 和 AMPK，实现了能量代谢与信号通路的协同整合，并据此开发了兼具光致发光与光声成像能力的 CitraBoneQMg 生物材料，在体内外均验证了其促骨再生、抗炎和神经再生的多重功效。未来研究可进一步阐明三分子升高胞内钙离子的具体机制，探索柠檬酸通过乙酰辅酶 A 介导的表观遗传调控在成骨中的作用，并评估降解产物是否保留代谢调控活性，从而推动柠檬酸基生物材料向临床转化。

论文信息

声明：本文仅用作学术目的。

Hui Xu et al. ,Metabotissugenic citrate biomaterials orchestrate bone regeneration via citrate-mediated signaling pathways.Sci. Adv.11,eady2862(2025).

doi:DOI:10.1126/sciadv.ady2862