单细胞悬液样本制备之Mouse肠道组织解离消化实验流程及步骤
一、实验整体流程
2. 分离出完整小肠，将小肠放入装有 10mL 1×PBS（abs962）的培养皿中。
注：处死小鼠后应尽快取出小肠组织，以防小肠离体缺氧时间太长造成细胞活率下降；另外可以使用含有 2% FBS 的预冷 1×PBS 浸泡小肠。
3. 使用眼科剪剪去小肠表面的派氏结，去除表面所有的脂肪和肠系膜残余组织；再用剪刀纵向剪开小肠暴露内容物，并在培养皿中冲洗干净。
注：可以使用预冷的 1×PBS 缓冲液冲洗 2-3 遍小肠组织，以防残留的内容物影响后续解离效果和细胞活率。
4. 随后将小肠分成 2cm 左右的小段，转移至装有 8mL 1×PBS（abs962）的 15mL 离心管中或者培养皿中。
三、机械联合酶消化解离
5. 取出上一步小肠组织转到含 10mL 洗液 1（abs50093-A）的 50mL 离心管中，37°C、220rpm 震荡 10min。
6. BS（abs962）的 1 2min，后将组织取出转移至含有 10mL PBS（abs962）的 15mL 离心管中，再次剧烈上下颠倒混匀 2min。
7. 下颠倒混匀 2min，重复 10mL 洗液 2（abs50093-B）的 50mL 离心管中，37°C、220rpm 震荡 10min。
8. 0 培养基后上下颠倒混匀 2min，重复步骤 6-7 一次。
9. 5mL 1640 培养基 2min，然后将小肠组织转移至含有 5mL 1640 培养基（abs9484）的 15mL 离心管，上下颠倒混匀 30s 以去除上一步残留的洗液 2。
注：在使用洗液 1 和洗液 2 后上下颠倒混匀时，颠倒混匀力度不要太剧烈，以防太过剧烈导致细胞活率降低。
10. 取 100mg 小肠组织，置于装有 2mL 组织解离液（abs50093-C）的 15mL 离心管中，并剪成 0.5cm 左右的小段，在 37°C 培养箱中静置消化 90min。
注：小肠不要剪得太碎，以防过碎导致过度消化、细胞破碎；另外可以在消化过程中每隔半小时上下颠倒混匀离心管。
11. 消化结束后，取出离心管剧烈震荡 3-5min，待组织充分破碎后，将消化液和破碎组织经 70μm 细胞筛过滤，并用 5-10mL 的 1×PBS（abs962）清洗 15mL 离心管后一并过滤收集。
12. 本实验配套对应操作演示400×g 室温离心 5min，弃去上清。 13. 可用于后续 1×PBS（abs962）重悬细胞沉淀，得到的细胞悬液可用于后续实验操作。
四、操作演示视频
本实验配套对应操作演示视频，可配合本流程同步参考，规范操作细节。 https://weixin.qq.com/sph/AyGU6BuiF2
五、流式质控检测
制备完成的单细胞悬液可通过流式细胞术进行质量控制，验证细胞活率、目标细胞类群比例等关键指标，确保样本质量符合下游实验要求。
实验所用全套试剂耗材均有对应成品供应，核心试剂货号可参考上述操作步骤中标注内容。
实验所用试剂耗材
2. 分离出完整小肠，将小肠放入装有 10mL 1×PBS（abs962）的培养皿中。
注：处死小鼠后应尽快取出小肠组织，以防小肠离体缺氧时间太长造成细胞活率下降；另外可以使用含有 2% FBS 的预冷 1×PBS 浸泡小肠。
3. 使用眼科剪剪去小肠表面的派氏结，去除表面所有的脂肪和肠系膜残余组织；再用剪刀纵向剪开小肠暴露内容物，并在培养皿中冲洗干净。
注：可以使用预冷的 1×PBS 缓冲液冲洗 2-3 遍小肠组织，以防残留的内容物影响后续解离效果和细胞活率。
4. 随后将小肠分成 2cm 左右的小段，转移至装有 8mL 1×PBS（abs962）的 15mL 离心管中或者培养皿中。
三、机械联合酶消化解离
5. 取出上一步小肠组织转到含 10mL 洗液 1（abs50093-A）的 50mL 离心管中，37°C、220rpm 震荡 10min。
6. BS（abs962）的 1 2min，后将组织取出转移至含有 10mL PBS（abs962）的 15mL 离心管中，再次剧烈上下颠倒混匀 2min。
7. 下颠倒混匀 2min，重复 10mL 洗液 2（abs50093-B）的 50mL 离心管中，37°C、220rpm 震荡 10min。
8. 0 培养基后上下颠倒混匀 2min，重复步骤 6-7 一次。
9. 5mL 1640 培养基 2min，然后将小肠组织转移至含有 5mL 1640 培养基（abs9484）的 15mL 离心管，上下颠倒混匀 30s 以去除上一步残留的洗液 2。
注：在使用洗液 1 和洗液 2 后上下颠倒混匀时，颠倒混匀力度不要太剧烈，以防太过剧烈导致细胞活率降低。
10. 取 100mg 小肠组织，置于装有 2mL 组织解离液（abs50093-C）的 15mL 离心管中，并剪成 0.5cm 左右的小段，在 37°C 培养箱中静置消化 90min。
注：小肠不要剪得太碎，以防过碎导致过度消化、细胞破碎；另外可以在消化过程中每隔半小时上下颠倒混匀离心管。
11. 消化结束后，取出离心管剧烈震荡 3-5min，待组织充分破碎后，将消化液和破碎组织经 70μm 细胞筛过滤，并用 5-10mL 的 1×PBS（abs962）清洗 15mL 离心管后一并过滤收集。
12. 本实验配套对应操作演示400×g 室温离心 5min，弃去上清。 13. 可用于后续 1×PBS（abs962）重悬细胞沉淀，得到的细胞悬液可用于后续实验操作。
四、操作演示视频
本实验配套对应操作演示视频，可配合本流程同步参考，规范操作细节。 https://weixin.qq.com/sph/AyGU6BuiF2
五、流式质控检测
制备完成的单细胞悬液可通过流式细胞术进行质量控制，验证细胞活率、目标细胞类群比例等关键指标，确保样本质量符合下游实验要求。
实验所用全套试剂耗材均有对应成品供应，核心试剂货号可参考上述操作步骤中标注内容。
实验所用试剂耗材
| 产品分类 | 产品编号 | 名称 | 规格 |
|---|---|---|---|
| 组织消化解离 | abs50093 | 小鼠肠道固有层组织解离试剂盒 | 10T/25T |
| 筛网 | abs7232 | 70um细胞筛网（200目，白色，底面过滤） | 50个/箱 |
| 免疫细胞预富集 | abs9102 | percoll | 100ml |
| 10XPBS缓冲液 | abs961 | PBS缓冲液（10×） | 500ml |
| 1640培养基 | abs9484 | RPMI 1640培养基（含L‑谷氨酰胺，不含HEPES） | 500ml |
| 红细胞裂解液（1×） | abs9101 | RBC Lysis Buffer | 100ml |
| 阻断FCR非特异性染色 | S0B0599 | Mouse FcR Blocking Reagent | 200T |
| 染色缓冲液 | abs9475 | Flow cytometry staining buffer | 500ml |
| 死活染料 | 559925 | 7‑AAD Staining Solution 2mL | 2ml |
| 流式鉴定 | S0B1692 | APC‑Cy7 Rat Anti‑Mouse CD45 Antibody (30‑F11) | 50T |
| 流式鉴定 | S0B5160 | PerCP‑Cy5.5 Rat Anti‑Mouse/Human CD11b Antibody (M1/70) | 50T |
