淋巴细胞亚群相对计数、绝对计数的实现方法及操作流程
一、为什么要做绝对计数：不能只看比例
在流式细胞仪的检测结果中，最常见的是百分比。比如说：CD4⁺T 细胞占淋巴细胞的 40%。只看比例，会产生误导：
A 样本淋巴细胞总数下降了一半，但 CD4⁺T 细胞比例还是 40%
B 样本淋巴细胞总数正常，CD4⁺T 细胞比例也是 40%
从比例上看，两组 CD4 比例相似，但实际上 A 样本的 CD4⁺T 细胞数量远远少于 B 样本。
绝对计数，就是直接说明 “到底有多少个细胞”，而不是只停留在 “占多少比例”。
• 阳性百分比：通过比较某个通道的阳性百分比，可以了解细胞亚群之间的比例关系
• 平均荧光强度：通过比较某个通道的平均荧光强度，可以了解细胞亚群的蛋白表达水平
• 细胞亚群之间的比例关系和蛋白表达水平，无法反映细胞的绝对数量变化
二、百分比告诉你占比，绝对计数告诉你真相
1. 绝对计数（Absolute Count） 指单位体积样本（如血液样本）中，含有某种类别细胞的数目，常用单位：个 / L、个 /μL。 计算公式： 绝对计数 = 检测到的细胞数目 / 输送到检测区的样本体积
2. 相对计数 指某种类别的细胞亚群，占其所属母群细胞总数的百分比，或两种独立细胞群之间的细胞数目比值。
3. 绝对计数的核心应用场景
• 疾病监测：HIV 患者的 CD4⁺T 细胞绝对数，是判断病情和疗效的关键指标
• 造血干细胞移植：外周血 CD34⁺细胞绝对数，用于评估采集和移植条件
• 肿瘤免疫疗法：免疫细胞真实数量的变化，比比例更能反映疗效
三、绝对计数的两种实现方法
方法一：使用细胞计数仪
• 原理：直接使用细胞计数仪对每个待上机的样本进行绝对计数
• 优点：结果准确，适合高精度需求的实验
• 缺点：需要专门的仪器支持，操作繁琐，耗时较长
方法二：使用绝对计数微球 / 微球管
• 原理：通过购买专门用于绝对计数的微球（如 BD 的绝对计数管），利用微球作为标准，完成绝对计数统计
• 优点：操作简单，适合大多数实验室，无需额外仪器
• 缺点：依赖商业产品，成本较高
四、BD 绝对计数管（TruCount）工作原理
1. 产品定义
绝对计数管是一种预装有准确定量微球（Beads）的流式管。
通过流式细胞仪获取数据后，计算各目标细胞群的相对含量（百分比），结合微球的准确定量，计算出目标细胞群的绝对含量。
2. 计算公式
绝对计数的本质是 “用已知数量的微球，校准未知数量的细胞”，关键在于 “同步采集” 和 “比例换算”：
1. 且微球的散：每管 TruCount 管（含微球的专用管）中的微球数量是出厂前精准标定的固定值（如 1000 个 / 管），且微球的散射和荧光特征稳定，不会与细胞混淆
2. 与微球的浓度：流式细胞仪同时采集样本中的 “细胞信号” 和 “微球信号”，两者的采集条件完全一致（如流速、时间），因此 “细胞数与微球数的比例” 能真实反映样本中细胞与微球的浓度比例
3. 换算逻辑：通过公式将 “相对比例” 转化为 “绝对浓度”，避免了 “仅测细胞比例无法反映实际数量” 的缺陷（例如：CD4⁺ T 细胞比例 50%，但血液中总白细胞数可能偏高或偏低，比例无法体现实际浓度）
五、实验案例：人外周血淋巴细胞亚群绝对计数 实验基础信息
六、样本完整处理流程
1. 抗体染色
• 将 TruCount 管中的冻干微球用 20 μL 抗体混合液重悬
• 向管中加入 50 μL 充分混匀的 EDTA 全血
• 室温避光孵育 25 分钟 2. 自动化溶血与固定 使用 TQ-Prep Workstation（Beckman Coulter）
2.进行标准化三步处理：
• 第一步：裂解红细胞
• 第二步：缓冲液中和并重悬白细胞
• 第三步：PFA 固定
3. 洗涤与重悬
• PBS 洗涤 2 次（300 × g，5 分钟）
• 细胞沉淀用 200 μL 含 1% PFA 的 PBS 重悬
4. 上机检测
尽量立即检测；如需暂存，4°C 避光保存不超过 4 小时
七、流式检测结果与门控逻辑
与其他所有检测面板类似，首先排除分析中的异常事件，随后鉴别细胞双联体并定义 “All cells”。
（E-J）主细胞群分群（顺序排除法）
按照严格的门控顺序鉴定各类主要细胞，通过逻辑门（即 “剩余细胞群”）将已鉴定的细胞类型从后续门控步骤中排除：
1. （E）白细胞圈门：依据 CD45 表达将白细胞与细胞碎片区分开
2. （F）T 细胞鉴定：鉴定 CD3⁺ T 细胞
3. （G）B 细胞鉴定：在 CD3⁻细胞中，通过 CD19 或 CD20 的表达鉴定 B 细胞
4. （H）髓系细胞鉴定：在剩余细胞中，依据独特的散射特征检测粒细胞和单核细胞
5. （I）NK 细胞鉴定：鉴定表达 CD56 和 / 或 CD16 的 NK 细胞
6. （J）剩余细胞群定义：将所有未鉴定的细胞定义为 “剩余细胞群”，其中包含树突状细胞（DC）、嗜碱性粒细胞或造血干细胞（HSC）等未明确鉴定的细胞
（K-L）细胞亚群细分 依据 CD16 的表达进一步细分粒细胞和单核细胞：
• 粒细胞分为：嗜酸性粒细胞（CD16⁻）、中性粒细胞（CD16⁺）
• 单核细胞分为：CD16⁺单核细胞、CD16⁻单核细胞
参考文献 Paul F. Rühle, Rainer Fietkau, Udo S. Gaipl * and Benjamin Frey. Development of a Modular Assay for Detailed Immunophenotyping of Peripheral Human Whole Blood Samples by Multicolor Flow Cytometry. Int. J. Mol. Sci. 2016, 17, 1316; doi:10.3390/ijms17081316.
八、相关产品清单
在流式细胞仪的检测结果中，最常见的是百分比。比如说：CD4⁺T 细胞占淋巴细胞的 40%。只看比例，会产生误导：
A 样本淋巴细胞总数下降了一半，但 CD4⁺T 细胞比例还是 40%
B 样本淋巴细胞总数正常，CD4⁺T 细胞比例也是 40%
从比例上看，两组 CD4 比例相似，但实际上 A 样本的 CD4⁺T 细胞数量远远少于 B 样本。
绝对计数，就是直接说明 “到底有多少个细胞”，而不是只停留在 “占多少比例”。
• 阳性百分比：通过比较某个通道的阳性百分比，可以了解细胞亚群之间的比例关系
• 平均荧光强度：通过比较某个通道的平均荧光强度，可以了解细胞亚群的蛋白表达水平
• 细胞亚群之间的比例关系和蛋白表达水平，无法反映细胞的绝对数量变化
二、百分比告诉你占比，绝对计数告诉你真相
1. 绝对计数（Absolute Count） 指单位体积样本（如血液样本）中，含有某种类别细胞的数目，常用单位：个 / L、个 /μL。 计算公式： 绝对计数 = 检测到的细胞数目 / 输送到检测区的样本体积
2. 相对计数 指某种类别的细胞亚群，占其所属母群细胞总数的百分比，或两种独立细胞群之间的细胞数目比值。
3. 绝对计数的核心应用场景
• 疾病监测：HIV 患者的 CD4⁺T 细胞绝对数，是判断病情和疗效的关键指标
• 造血干细胞移植：外周血 CD34⁺细胞绝对数，用于评估采集和移植条件
• 肿瘤免疫疗法：免疫细胞真实数量的变化，比比例更能反映疗效
三、绝对计数的两种实现方法
方法一：使用细胞计数仪
• 原理：直接使用细胞计数仪对每个待上机的样本进行绝对计数
• 优点：结果准确，适合高精度需求的实验
• 缺点：需要专门的仪器支持，操作繁琐，耗时较长
方法二：使用绝对计数微球 / 微球管
• 原理：通过购买专门用于绝对计数的微球（如 BD 的绝对计数管），利用微球作为标准，完成绝对计数统计
• 优点：操作简单，适合大多数实验室，无需额外仪器
• 缺点：依赖商业产品，成本较高
四、BD 绝对计数管（TruCount）工作原理
1. 产品定义
绝对计数管是一种预装有准确定量微球（Beads）的流式管。
通过流式细胞仪获取数据后，计算各目标细胞群的相对含量（百分比），结合微球的准确定量，计算出目标细胞群的绝对含量。
2. 计算公式
绝对计数的本质是 “用已知数量的微球，校准未知数量的细胞”，关键在于 “同步采集” 和 “比例换算”：
1. 且微球的散：每管 TruCount 管（含微球的专用管）中的微球数量是出厂前精准标定的固定值（如 1000 个 / 管），且微球的散射和荧光特征稳定，不会与细胞混淆
2. 与微球的浓度：流式细胞仪同时采集样本中的 “细胞信号” 和 “微球信号”，两者的采集条件完全一致（如流速、时间），因此 “细胞数与微球数的比例” 能真实反映样本中细胞与微球的浓度比例
3. 换算逻辑：通过公式将 “相对比例” 转化为 “绝对浓度”，避免了 “仅测细胞比例无法反映实际数量” 的缺陷（例如：CD4⁺ T 细胞比例 50%，但血液中总白细胞数可能偏高或偏低，比例无法体现实际浓度）
五、实验案例：人外周血淋巴细胞亚群绝对计数 实验基础信息
| 项目 | 详情 |
|---|---|
| 样本来源 | 人外周静脉全血（EDTA‑Monovette 真空采血管） |
| 体积 & 处理方式 | 50 μL 全血（4 小时内完成实验） |
| 绝对计数方法 | TruCount tubes（BD#340334） |
| 抗体组合 | CD19/CD20‑FITC CD16‑PE CD56‑PC5.5 CD45‑PC7 CD3‑APC |
六、样本完整处理流程
1. 抗体染色
• 将 TruCount 管中的冻干微球用 20 μL 抗体混合液重悬
• 向管中加入 50 μL 充分混匀的 EDTA 全血
• 室温避光孵育 25 分钟 2. 自动化溶血与固定 使用 TQ-Prep Workstation（Beckman Coulter）
2.进行标准化三步处理：
• 第一步：裂解红细胞
• 第二步：缓冲液中和并重悬白细胞
• 第三步：PFA 固定
3. 洗涤与重悬
• PBS 洗涤 2 次（300 × g，5 分钟）
• 细胞沉淀用 200 μL 含 1% PFA 的 PBS 重悬
4. 上机检测
尽量立即检测；如需暂存，4°C 避光保存不超过 4 小时
七、流式检测结果与门控逻辑
与其他所有检测面板类似，首先排除分析中的异常事件，随后鉴别细胞双联体并定义 “All cells”。
（E-J）主细胞群分群（顺序排除法）
按照严格的门控顺序鉴定各类主要细胞，通过逻辑门（即 “剩余细胞群”）将已鉴定的细胞类型从后续门控步骤中排除：
1. （E）白细胞圈门：依据 CD45 表达将白细胞与细胞碎片区分开
2. （F）T 细胞鉴定：鉴定 CD3⁺ T 细胞
3. （G）B 细胞鉴定：在 CD3⁻细胞中，通过 CD19 或 CD20 的表达鉴定 B 细胞
4. （H）髓系细胞鉴定：在剩余细胞中，依据独特的散射特征检测粒细胞和单核细胞
5. （I）NK 细胞鉴定：鉴定表达 CD56 和 / 或 CD16 的 NK 细胞
6. （J）剩余细胞群定义：将所有未鉴定的细胞定义为 “剩余细胞群”，其中包含树突状细胞（DC）、嗜碱性粒细胞或造血干细胞（HSC）等未明确鉴定的细胞
（K-L）细胞亚群细分 依据 CD16 的表达进一步细分粒细胞和单核细胞：
• 粒细胞分为：嗜酸性粒细胞（CD16⁻）、中性粒细胞（CD16⁺）
• 单核细胞分为：CD16⁺单核细胞、CD16⁻单核细胞
参考文献 Paul F. Rühle, Rainer Fietkau, Udo S. Gaipl * and Benjamin Frey. Development of a Modular Assay for Detailed Immunophenotyping of Peripheral Human Whole Blood Samples by Multicolor Flow Cytometry. Int. J. Mol. Sci. 2016, 17, 1316; doi:10.3390/ijms17081316.
八、相关产品清单
| 目标抗原 | 荧光素 | 克隆号 | 货号 | 规格 |
|---|---|---|---|---|
| CD20 | FITC | 2H7 | 556632 | 50 tests |
| CD16 | PE | 3G8 | 556618 | 50 tests |
| CD56 | RB705 (PerCP‑Cy5.5) | MY31 | 757214 | 50 tests |
| CD45 | PC7 (PE‑Cy7) | D058‑1283 | 561294 | 50 tests |
| CD3 | APC | SP34‑2 | 557597 | 50 tests |
| Trucount 绝对计数管 | - | - | 340334 | 50 tests |
| BD Lysing Solution 10X Concentrate | - | - | 349202 | 50 tests |
