小鼠骨髓样本中的中性粒细胞分选与获得实验流程及步骤
一、实验整体流程
2. 处死小鼠后，取股骨和胫骨，用无菌工具剥离骨表面所有皮肤、肌肉和肌腱。
3. 将清洁完成的骨头放入含收集缓冲液的 6 孔板孔中，全程保持冰上操作。
4. 所有骨头收集并清洁后，剪去骨骺，将骨头剪口朝下放入 0.5/1.5 mL 离心管组合中。
5. 离心法冲出骨髓：室温（20–25°C）条件下 10,000×g 离心 30 秒。
6. 弃去骨头，将收集到的细胞沉淀用 1 mL 重悬缓冲液轻柔重悬，避免产生气泡，随后转移至 15 mL 锥形管。
7. 红细胞裂解：针对 1 mL 细胞悬液，加入 10 mL 红细胞裂解缓冲液，轻轻颠倒混匀，室温孵育 2 分钟。切勿涡旋。
8. 4°C 条件下 300×g 离心 10 分钟。
9. 准备 70 μm 细胞筛，用 2 mL 重悬缓冲液润洗。
10. 吸弃上清，用 5 mL 重悬缓冲液重悬细胞沉淀。
11. 将 5 mL 细胞悬液通过 70 μm 滤网过滤，再用 5 mL 重悬缓冲液冲洗滤网。
12. 4°C 条件下 300×g 离心 10 分钟。
13. 弃上清，用 1 mL 重悬缓冲液重悬细胞沉淀。
14. 细胞计数与活力检测：取 15 μL 细胞悬液与 15 μL 台盼蓝混合，取 15 μL 混合液上样至 Countess 计数玻片，用自动细胞计数仪完成计数；若无自动计数仪，可改用血球计数板。
三、磁珠孵育染色与润柱
1. 用 100μL MagSep Separation Buffer 重悬 1×10^7 个细胞
注意：试剂用量可根据样品体积等比例调整；需留存分选前样本，用于检测中性粒细胞初始比例。
2. 向样品中加入 10 μL Mouse Neutrophil Biotin Antibody Cocktail，轻轻混匀
注意：本步骤混匀可采用移液器轻轻吹打 2-3 下。
3. 使抗体与细胞充分结合，2-8℃条件下孵育 10 min。
4. 充分混匀 Streptavidin Beads，向样品中加入 15 μL Streptavidin Beads。
5. 轻柔混匀磁珠与细胞，2-8℃条件下孵育 15 min。
6. 加入 10 倍细胞体积的 MagSep Separation Buffer 洗涤细胞，400g 离心 7min 后弃去上清，重悬至原体积。
1. 将细胞悬液上样至分选柱，收集流出液，即未标记的阴性细胞组分。
2. 用缓冲液洗涤柱子 3 次，每次 500μL；待柱内液体完全流空后，再加入下一次洗涤液。
3. 合并所有流出液作为阴性组分；将分选柱移出磁场，置于收集管上方。
4. 向柱内加入 1mL 缓冲液，用配套柱塞快速、用力推压，洗脱磁性标记的阳性细胞。
注意：如需更高纯度，可换用新柱重复分选 1 次。
通过流式细胞术分别对分选前样本、分选后阳性成分、分选后阴性成分进行检测，鉴定中性粒细胞的比例与纯度，验证分选富集效果。
分选前
二、骨髓样本制备
2. 处死小鼠后，取股骨和胫骨，用无菌工具剥离骨表面所有皮肤、肌肉和肌腱。
3. 将清洁完成的骨头放入含收集缓冲液的 6 孔板孔中，全程保持冰上操作。
4. 所有骨头收集并清洁后，剪去骨骺，将骨头剪口朝下放入 0.5/1.5 mL 离心管组合中。
5. 离心法冲出骨髓：室温（20–25°C）条件下 10,000×g 离心 30 秒。
6. 弃去骨头，将收集到的细胞沉淀用 1 mL 重悬缓冲液轻柔重悬，避免产生气泡，随后转移至 15 mL 锥形管。
7. 红细胞裂解：针对 1 mL 细胞悬液，加入 10 mL 红细胞裂解缓冲液，轻轻颠倒混匀，室温孵育 2 分钟。切勿涡旋。
8. 4°C 条件下 300×g 离心 10 分钟。
9. 准备 70 μm 细胞筛，用 2 mL 重悬缓冲液润洗。
10. 吸弃上清，用 5 mL 重悬缓冲液重悬细胞沉淀。
11. 将 5 mL 细胞悬液通过 70 μm 滤网过滤，再用 5 mL 重悬缓冲液冲洗滤网。
12. 4°C 条件下 300×g 离心 10 分钟。
13. 弃上清，用 1 mL 重悬缓冲液重悬细胞沉淀。
14. 细胞计数与活力检测：取 15 μL 细胞悬液与 15 μL 台盼蓝混合，取 15 μL 混合液上样至 Countess 计数玻片，用自动细胞计数仪完成计数；若无自动计数仪，可改用血球计数板。
三、磁珠孵育染色与润柱
1. 用 100μL MagSep Separation Buffer 重悬 1×10^7 个细胞
注意：试剂用量可根据样品体积等比例调整；需留存分选前样本，用于检测中性粒细胞初始比例。
2. 向样品中加入 10 μL Mouse Neutrophil Biotin Antibody Cocktail，轻轻混匀
注意：本步骤混匀可采用移液器轻轻吹打 2-3 下。
3. 使抗体与细胞充分结合，2-8℃条件下孵育 10 min。
4. 充分混匀 Streptavidin Beads，向样品中加入 15 μL Streptavidin Beads。
5. 轻柔混匀磁珠与细胞，2-8℃条件下孵育 15 min。
6. 加入 10 倍细胞体积的 MagSep Separation Buffer 洗涤细胞，400g 离心 7min 后弃去上清，重悬至原体积。
1. 将细胞悬液上样至分选柱，收集流出液，即未标记的阴性细胞组分。
2. 用缓冲液洗涤柱子 3 次，每次 500μL；待柱内液体完全流空后，再加入下一次洗涤液。
3. 合并所有流出液作为阴性组分；将分选柱移出磁场，置于收集管上方。
4. 向柱内加入 1mL 缓冲液，用配套柱塞快速、用力推压，洗脱磁性标记的阳性细胞。
注意：如需更高纯度，可换用新柱重复分选 1 次。
通过流式细胞术分别对分选前样本、分选后阳性成分、分选后阴性成分进行检测，鉴定中性粒细胞的比例与纯度，验证分选富集效果。
分选前
| 产品分类 | 产品编号 | 产品名称 | 规格 |
|---|---|---|---|
| 分选磁珠 | S0K1015 | Mouse Neutrophil Isolation Kit (Column‑Based) | 1ml/2ml |
| 分选架 | S0D3005 | MultiStand | 1pc |
| 分选器 | S0D3001 | Starter MagSep Separator (L) | 1pc |
| 分选柱 | S0D3011 | L Separation Columns | 25 Columns |
| 分选缓冲液 | S0D3018 | Starter MagSep Separation Buffer | 250ml |
| 细胞筛网 | abs7231 | 40μm 细胞筛网（300 目，蓝色，底面过滤） | 50 个 / 箱 |
| 红细胞裂解 | abs9101 | RBC Lysis Buffer（红细胞裂解液 1×） | 100ml |
| 封闭试剂 | S0B0599 | Mouse FcR Blocking Reagent（阻断 FcR 非特异性染色） | 200T |
| 染色缓冲液 | abs9475 | Flow cytometry staining buffer | 500ml |
| 流式鉴定 | S0B1666 | PerCP‑Cy5.5 Rat Anti‑Mouse CD45 Antibody (30‑F11) | 50T |
| 流式鉴定 | S0B1808 | FITC Rat Anti‑Mouse/Human CD11b Antibody (M1/70) | 50T |
