通窍活血汤促进缺血性中风后脑微动脉生成的机制研究

文章标题：S1P-mediated cerebral microarteriogenesis induced by Tong-Qiao-Huo-Xue decoction after ischemia-reperfusion

发表期刊：Phytomedicine (IF 11.3)

合作客户：安徽中医药大学汪宁、王磊团队

维真生物助力：

体内实验

基因信息：S1P1，S1P受体

病毒产品：AAV9-S1P1-shRNA

实验动物：雄性Sprague Dawley大鼠（250±20 g）

注射方式：立体定位注射

注射部位及剂量：左侧脑室，10μL

体外实验

病毒产品：Lv-S1P1-shRNA

病毒滴度：4.0 × 10^8 TU/mL

实验细胞：脑微血管平滑肌细胞BMSMCs

研究背景

通窍活血汤（TQHXD）是一种活血化瘀、改善缺血性中风预后的经典中药方剂，其促进脑微动脉生成的作用机制尚不清楚。本研究探讨了TQHXD在促进缺血性中风后脑微动脉生成中的作用，发现TQHXD过激活S1P1/RAS/RAF/MEK/ERK信号通路，促进脑微动脉形成，恢复脑血流灌注，改善脑侧支循环，为TQHXD治疗缺血性中风的临床应用提供了实验依据。

部分结果展示

1. TQHXD可调节CD31、SM22、α-SMA、S1P和S1P1表达

作者构建大鼠大脑中动脉闭塞再灌注模型（MCAO/R），用于研究TQHXD对缺血性脑卒中的影响，研究发现TQHXD显著改善MCAO/R大鼠的学习记忆能力和精神状态，缓解MCAO/R大鼠的病理损伤，并通过促进脑侧支循环微动脉的形成，进而促进脑血流量的恢复，改善脑梗死。作者进一步研究了TQHXD的作用机制，发现TQHXD治疗后，BMSMC中表型相关蛋白α-SMA和SM22的水平显著降低，表明细胞发生了表型转换，从而增强了其增殖能力；而KD-S1P1组则表现出相反的趋势。此外作者还研究了TQHXD对S1P介导的下游信号通路的影响，发现TQHXD显著上调S1P1、RAS、RAF、MEK和ERK的水平，而KD-S1P1组则表现出相反的趋势，Co-IP表明TQHXD促进S1P1与其下游信号分子RAS、MEK和ERK的相互作用。这些结果表明TQHXD可能通过S1P1/RAS/RAF/MEK/ERK途径促进BMSMCs的表型转化并增强细胞增殖和迁移。

图1 TQHXD影响SM22、α-SMA、S1P和S1P1的表达

2. TQHXD-CSF显著促进OGD/R损伤的BMSMCs的增殖和迁移

作者构建了体外间接共培养的BMEC和BMSMCs缺氧/复氧损伤模型（OGD/R），在体外再次验证TQHXD的作用机制。发现TQHXD-CSF（TQHXD处理大鼠的脑脊液）显著增强BMSMC活力并减少细胞凋亡。伤口愈合实验显示TQHXD-CSF显著促进细胞迁移，而S1P1敲低产生相反的效果。流式细胞术分析显示，TQHXD-CSF处理减少了G1期细胞的比例，增加了S期细胞的比例，而KD-S1P1处理则表现出相反的趋势，表明TQHXD-CSF促进了BMSMCs增殖。机制研究发现TQHXD-CSF可下调OGD/R损伤BMSMCs中SM22和α-SMA的表达，上调CD31、S1P和S1P1的表达，表明TQHXD可以促进BMSMCs的表型转换，从而增强其增殖和迁移能力，此外TQHXD显著上调S1P1、RAS、RAF、MEK和ERK的水平，而KD-S1P1组表现出相反的趋势，表明TQHXD通过S1P介导的S1P1/RAS/RAF/MEK/ERK信号通路促进BMSMC表型转化、增殖和迁移。

图2 TQHXD促进细胞增殖和迁移

实验结论

本研究建立了大鼠大脑中动脉闭塞再灌注（MCAO/R）模型和体外间接共培养的BMEC和BMSMCs缺氧/复氧（OGD/R）损伤模型，从体内和体外两个水平研究了TQHXD的作用机制，发现TQHXD通过激活S1P1/RAS/RAF/MEK/ERK信号通路诱导BMSMCs表型转换，增强BMSMCs的增殖和迁移，从而促进微动脉生成，为TQHXD治疗缺血性中风的临床应用提供了实验依据。