T细胞耗竭（T Cell Exhaustion）研究模型的建立方法
一、T 细胞耗竭的本质与渐进发展
1. 核心特征
T 细胞耗竭呈现渐进式发展过程，细胞状态从功能激活逐步过渡至终末失能。
2. 淋巴细胞耗竭的定义
淋巴细胞耗竭的本质，是由持续抗原刺激（慢性感染、肿瘤）诱导的、功能渐进性受损且增殖能力下降的状态，与淋巴细胞无能、细胞衰老、免疫抑制存在明确区别：
• 无能：由活化受体刺激不足引发的低反应状态；
• 衰老：由细胞老化、DNA 损伤等导致的永久性周期停滞；
• 抑制：由缺氧、细胞因子、调节性细胞等外源非抗原因素造成的功能障碍
参考文献：Nat Rev Immunol. 2015 Aug;15 (8):486-99.
• 抑制受体：PD-1、LAG-3、TIM-3、TIGIT、CTLA-4、BTLA 持续高表达，受体表达数量与耗竭程度正相关；
• 功能因子：IL-2、IFN-γ、TNF-α、穿孔素、颗粒酶水平下降；
• 转录调控：TOX、NFAT 是表观重编程核心分子，可通过破膜染色辅助判定
参考文献：Annu. Rev. Immunol. 2024. 42:179–206
四、耗竭 T 细胞的三类主流研究模型
参考文献： Nat Med 1999;5:677–85 iScience 2018; 2:105–22 PLoS Pathog 2020;16:e1008555 Nat Commun 2023;14:86
五、人源体外 T 细胞耗竭模型建立方案
六、流式检测指标选择方案
1. T 细胞亚群表型定义
2. 核心检测 Panel 与指标
• 经典耗竭 Panel：CD8+ PD-1+ TIM3+ LAG-3+ TIGIT+
• 干性 - 耗竭联合 Panel：CD8+ TCF1+ TOX+ PD-1int（TSL） vs. CD8+ TCF1- TOX+ TIM3+（终末耗竭）
• 空间定位标志物：CXCR6（定位在肿瘤微环境靠近 DCs 的区域）
• 转录因子检测：TCF1、TOX、BACH2、FOXO1、MYB、EOMES、T-BET、IRF4、BATF
• 磷酸化信号蛋白：p-STAT5、p-STAT3 等，用于检测信号通路激活状态
• 增殖检测：Ki-67
• 细胞因子分泌：CD8+ T 细胞分泌 IFN-γ、TNF-α、IL-2 水平下降
• 线粒体功能：MitoTracker 染色，评估耗竭 T 细胞的线粒体质量与膜电位
1. 核心特征
T 细胞耗竭呈现渐进式发展过程，细胞状态从功能激活逐步过渡至终末失能。
2. 淋巴细胞耗竭的定义
淋巴细胞耗竭的本质，是由持续抗原刺激（慢性感染、肿瘤）诱导的、功能渐进性受损且增殖能力下降的状态，与淋巴细胞无能、细胞衰老、免疫抑制存在明确区别：
• 无能：由活化受体刺激不足引发的低反应状态；
• 衰老：由细胞老化、DNA 损伤等导致的永久性周期停滞；
• 抑制：由缺氧、细胞因子、调节性细胞等外源非抗原因素造成的功能障碍
参考文献：Nat Rev Immunol. 2015 Aug;15 (8):486-99.
• 抑制受体：PD-1、LAG-3、TIM-3、TIGIT、CTLA-4、BTLA 持续高表达，受体表达数量与耗竭程度正相关；
• 功能因子：IL-2、IFN-γ、TNF-α、穿孔素、颗粒酶水平下降；
• 转录调控：TOX、NFAT 是表观重编程核心分子，可通过破膜染色辅助判定
| 耗竭阶段 | 表面标志物 | 转录因子 / 调控因子 | 代谢相关标记 | 功能标记 | 表观遗传标记 |
|---|---|---|---|---|---|
| 早期耗竭 | PD-1, LAG-3, CTLA-4 | TOX, TCF7, BATF | CD71 (高), CD98 (高) | IFN-γ(部分保留) | H3K4me1 (开放染色质) |
| 中期耗竭 | PD-1+, TIM-3+, TIGIT+ | BLIMP-1, IRF4, NFATc1 | GLUT1 (下调) | TNF-α(减少) | DNMT3A (甲基化起始) |
| 晚期耗竭 | PD-1hi, TIM-3hi, CD39+ | EOMES, NR4A, FOXO1 | PGC-1α(低) | Granzyme B (保留) | H3K27me3 (抑制性修饰) |
| 干细胞样耗竭 | PD-1+, CXCR5+, CD62L+ | TCF1, LEF1, BCL6 | CPT1A (线粒体代谢) | IL-2 (丧失) | 染色质可塑性保留 |
| 组织驻留耗竭 | CD69+, CD103+, CD49a+ | Hobit, Runx3 | LDHA (高) | Perforin (低) | 组织特异性甲基化模式 |
| 可逆性耗竭 | PD-1+, CD28- | AP-1 复合物低表达 | 糖酵解增强 | 增殖能力部分恢复 | 可逆性表观沉默区域 |
四、耗竭 T 细胞的三类主流研究模型
| 模型 | 实验方法 | 优点 | 缺点 | 适用场景 |
|---|---|---|---|---|
| 小鼠模型 | LCMV 克隆 13 或 LCMV‑D 病毒感染小鼠；过继转移 CD45.1+ T 细胞至 CD45.2 + 小鼠模型 | 可追踪 T 细胞动态（原位），适合机制研究 | 耗时（30 天），细胞量少（需合并样本），转化到人类存在挑战 | 慢性感染 / 肿瘤中 T 细胞耗竭机制研究 |
| 人体组织分离模型 | 从慢性感染（HIV/HBV/HCV）或肿瘤患者组织中分离 T 细胞，MHC 四聚体分选 | 直接获取临床样本，反映真实耗竭终末状态 | 样本来源不稳定，无法动态追踪耗竭过程 | 临床样本分析、耗竭 T 细胞终末表型研究 |
| 体外刺激模型 | 抗体刺激：抗 CD3/CD28 磁珠持续激活 T 细胞（8‑14 天）；抗原刺激：抗原肽 / 肿瘤细胞重复刺激 | 高通量、易操作，可生成大量耗竭样细胞，适合药物筛选与功能验证 | 可能不完全模拟体内耗竭（如凋亡干扰），需严格条件控制 | 药物筛选、耗竭标志物鉴定、体外功能验证 |
五、人源体外 T 细胞耗竭模型建立方案
| 用途 | 产品编号 | 产品名称 | 规格 |
|---|---|---|---|
| CD8+T 分选 | S0K0010 | CD8 Nanobeads, human（RUO） | 1mL/2mL |
| 分选器 / 磁铁 | S0D3004 | Starter MagSep Separator (8S) | 盒 |
| 分选柱 | S0D3012 | S Separation Columns | 25 个 / 盒 |
| 分选架 | S0D3005 | MultiStand | 个 |
| 分选 Buffer | S0D3018 | Starter MagSep Separation Buffer | 250ml |
| CD3/CD28 激活磁珠 | S0K0020 | T Cell Activation Nanobeads，Human（RUO） | 0.5mL/1mL |
| Anti CD3 功能抗体 | S0B0009 | NA/LE Mouse anti‑human CD3 mAb | 1mg/5mg/25mg/50mg/100mg |
| Anti CD28 功能抗体 | S0B0010 | NA/LE Mouse anti‑human CD28 mAb | 1mg/5mg/25mg/50mg/100mg |
六、流式检测指标选择方案
1. T 细胞亚群表型定义
| 细胞亚群名称 | 表型标记组合 |
|---|---|
| 干细胞样耗竭 T 细胞（TSL/TPEX） | TCF1+ PD‑1int TIM3‑ CD101‑ |
| 过渡性耗竭 T 细胞（TEX‑Trans） | CD101‑ TIM3+ |
| 终末耗竭 T 细胞（TEX‑Term） | CD101+ TIM3+ CD69+ |
| 效应样耗竭 T 细胞（eff‑like TEX） | KLRG1+ CX3CR1+ |
| 干细胞样记忆 T 细胞（TSCM） | CD62L+ CD45RA+ CCR7+ IL‑7Rα+ |
| 中枢记忆 T 细胞（TCM） | CD62L+ CD45RA‑ |
| 效应记忆 T 细胞（TEM） | CD62L‑ CD45RA‑ |
| CD45RA + 效应记忆 T 细胞（TEMRA） | CD62L‑ CD45RA+ |
| 组织驻留记忆 T 细胞（TRM） | CD69+ CD103+（部分组织） |
| 效应 T 细胞（TEFF） | KLRG1hi CD127lo |
• 经典耗竭 Panel：CD8+ PD-1+ TIM3+ LAG-3+ TIGIT+
• 干性 - 耗竭联合 Panel：CD8+ TCF1+ TOX+ PD-1int（TSL） vs. CD8+ TCF1- TOX+ TIM3+（终末耗竭）
• 空间定位标志物：CXCR6（定位在肿瘤微环境靠近 DCs 的区域）
• 转录因子检测：TCF1、TOX、BACH2、FOXO1、MYB、EOMES、T-BET、IRF4、BATF
• 磷酸化信号蛋白：p-STAT5、p-STAT3 等，用于检测信号通路激活状态
• 增殖检测：Ki-67
• 细胞因子分泌：CD8+ T 细胞分泌 IFN-γ、TNF-α、IL-2 水平下降
• 线粒体功能：MitoTracker 染色，评估耗竭 T 细胞的线粒体质量与膜电位
| 目的细胞 | 指标 | 荧光素 | 货号 | 产品名称 | 克隆号 | 规格 |
|---|---|---|---|---|---|---|
| 区分活 / 死细胞 | Live/Dead | BV510 | S0B88802 | Fixable Viability Dye 545 | - | 50T |
| 免疫细胞圈门 | CD45 | APC‑CY7 | S0B8198 | APC‑Cy7 Mouse Anti‑Human CD45 Antibody | S‑3269 | 50T |
| T 细胞圈门 | CD3 | FITC | S0B1765 | FITC Mouse Anti‑Human CD3 Antibody | HIT3a | 50T |
| 辅助性 T 细胞 | CD4 | PE(RY586) | 753345 | Hu CD4 RY586 L200 50ug | L200 | 50T |
| 细胞毒性 T 细胞 | CD8 | APC | S0B5658 | APC Mouse Anti‑Human CD8 Antibody | S‑R533 | 50T |
| 耗竭 T 细胞检测 | PD‑1 | Percp cy5.5(RB705) | 570246 | RB705 Mouse Anti‑HumanCD279 (PD‑1) | EH12.1 | 50T |
| 耗竭 T 细胞检测 | LAG‑3 | PE‑CY5(RB670) | 771756 | RB670 Mouse Anti‑Human CD223 (LAG‑3) | T47‑530 | 50T |
| 耗竭 T 细胞检测 | TIM‑3 | BV421 | 747962 | BV421 Rat Anti‑HumanCD366 (TIM‑3) | 344823 | 50T |
| 循环 / 组织驻留亚群区分 | CD69 | PE‑CY7(RB780,RY775) | 560712 | PE‑Cy7 Mouse Anti‑Human CD69 | FN50 | 50T |
| 效应功能评估 | IFNγ | BV650 | 563416 | Hu IFN‑GMA BV650 4S.B3 50Tst | 4S.B3 | 50T |
| 细胞毒性功能评估 | CD107a | R718 | 567220 | Hu CD107a R718 H4A3 25Tst | H4A3 | 50T |
| 终末耗竭状态评估 | Eomes | PE‑CF594(RY610,RB613) | 571363 | RB613 Mouse Anti‑EOMES | X4‑83 | 50T |
