从采样到功能验证：基因编辑小鼠的全流程分子实验介绍
做基因编辑小鼠实验的同学，谁没为基因型鉴定熬过夜？明明加样全对，电泳却跑出一片模糊条带；好不容易鉴定出正确基因型小鼠，验证表达却又完全没差异；想验证表型却找不到适配的实验方法……作为生物医药研究的核心模式动物，基因编辑小鼠的每一步结果都离不开严谨的分子实验支撑。今天我们就把从采样到功能验证的全流程常用分子实验一次性讲透，帮你避开90%的常见坑。
一、基础入门：基因型鉴定核心实验
基因型鉴定是所有基因编辑小鼠实验的第一步，也是决定后续实验能否推进的关键。这部分实验的核心目标，就是快速、准确区分野生型、杂合子和纯合子小鼠，从一众子代鼠里挑出符合实验要求的个体。基因型鉴定的核心是PCR技术。其基本原理是利用基因编辑小鼠与野生型小鼠基因组的序列差异，设计特异性引物进行PCR扩增，再通过凝胶电泳根据条带大小和数量来区分不同基因型。
不同类型的小鼠，鉴定方案各有侧重：
01 基因敲除鼠的鉴定
- 阳性鼠鉴定：在敲除片段的两端设计引物。如果敲除成功，PCR产物的条带会比野生型小（大小 = 野生型片段 - 敲除片段）。
- 纯合/杂合子鉴定：阳性鼠（杂合子）自交后会产生野生型、杂合子和纯合子三种后代。若敲除片段不大，上述一对引物即可区分（图1）。若敲除片段过大导致野生型片段无法扩增，则需要在敲除片段内部再设计一条引物，通过两对引物PCR来区分（图2）。PCR后对目标编辑区域进行Sanger测序能精准确认碱基序列的变化，判断编辑是否完全符合预期。
图1. 短片段敲除电泳条带示意图
图2. 长片段敲除三引物电泳示意图
02 基因敲入/条件性敲除鼠的鉴定
这类模型（如flox小鼠）的鉴定更为复杂，需要验证同源臂和loxP位点是否正确插入。
- F0代验证：通常需要多对引物分别验证5'同源臂、3'同源臂和两端的loxP位点。
- F1代验证：PCR阳性结果后，通常还需Southern Blot进一步确认。
- F2代纯杂合鉴定：F1代自交后，只需用一对位于loxP位点附近的引物进行PCR，根据条带大小即可区分野生型、杂合子和纯合子（图3）。
图3. flox鼠鉴定原理与条带示意图
03 点突变小鼠的鉴定
点突变由于只是单碱基或少数碱基的增加、缺失或替换，无法通过电泳条带大小进行区分。
- 酶切法：若突变引入或破坏了某个限制性内切酶的识别位点，可通过PCR后对产物进行酶切来鉴定。
- 测序法：最可靠的方法是将PCR产物直接测序，通过分析峰图确认点突变（图4）。
图4. 野生型 / 杂合 / 纯合点突变测序峰图对比
04 随机转基因小鼠
对于随机插入的转基因小鼠，必须确认外源基因的整合情况才能保证后续实验的稳定性。再确认插入位置前只能通过阳性和阴性作为区分，并且阳性鼠繁育只能和WT进行繁育。插入位置可通过染色体荧光原位杂交实验在显微镜下直接观察外源基因在染色体上的定位，或全基因组测序确定它整合到了哪一条染色体的具体位置；而定量斑点杂交、数字PCR实验，则能精准统计外源基因在基因组中的整合拷贝数，避免因为多拷贝随机插入导致后续传代表型分离。
注意事项
- DNA模板：高质量DNA是成功的关键。常用鼠尾或脚趾、耳朵组织，通过碱裂解法或酶消化法（如蛋白酶K）提取DNA，OD值260/280在2.0左右，PCR上样DNA量控制在50-100ng。
- 对照设置：实验必须包含野生型对照、空白对照（无DNA模板）和内部阳性对照。
- 引物与程序：引物设计要特异，GC含量在40%-60%。对于复杂模板，可尝试梯度降落PCR（Touch down PCR）减少非特异性扩增。
二、表达层面验证：功能确认核心实验
基因型正确不代表基因能正常表达，做完DNA水平的验证后，还需要在RNA和蛋白层面确认编辑后的基因是否正常转录、翻译，才能最终判定小鼠模型构建成功。
01 RT-PCR/荧光定量PCR实验
从目标组织中提取总RNA，逆转录合成cDNA后进行扩增，既能定性检测目的基因的mRNA是否存在，也能通过荧光定量的方式精准统计基因的表达水平。特别适合检测基因全身性敲除小鼠的目标基因是否完全敲除，条件性敲除目的基因敲除效率或者过表达小鼠的外源基因是否在特定组织中成功转录。
如果目标基因和内源同源基因序列相似度很高，选择高特异性的引物，就能有效避免非特异性扩增带来的结果误差。
02 Northern Blot实验
这是RNA水平检测的经典方法，将提取的总RNA电泳转膜后，用特异性探针杂交，直接显示目标mRNA的大小和表达量。它能直观验证转录本的完整性，判断是否出现异常剪接的转录产物，在转基因和内源基因序列差异较大的场景中应用非常广泛。
03 Western Blot蛋白免疫印迹实验
直接从组织中提取总蛋白，通过电泳、转膜后用特异性抗体检测目标蛋白的表达情况，确认基因编辑是否成功实现了蛋白层面的功能改变。比如构建全身性敲除小鼠，就需要通过Western Blot验证在目标组织中，目的蛋白是否完全不表达，或条件性基因敲除小鼠后验证除目标组织外其他非靶向组织中蛋白表达不受影响等。
04 免疫组化/免疫荧光实验
除了验证蛋白是否表达，还能直观看到蛋白在组织中的定位和表达分布。比如构建的荧光报告基因小鼠，通过免疫荧光染色就能直接在显微镜下观察到荧光蛋白在不同组织、不同细胞类型中的表达情况，验证报告系统的工作效率。
三、高阶应用：功能研究拓展实验
完成基础的基因型和表达验证后，想要深入开展机制研究，这些进阶的分子实验能帮你挖掘更多模型的科研价值。比如下面几种实验：
- 单细胞测序实验：能从单个细胞层面解析基因编辑后不同细胞类群的转录组变化。
- 组织学染色：通过HE染色观察组织病理变化或用油红O染色观察脂质积聚等。
- 生理生化指标检测：检测血液中的血脂、血糖等生理生化指标。
- 免疫学：ELISA, ELISPOT, 胞内流式, 增殖/杀伤实验，肿瘤药效等。
- 行为学：旷场实验、明暗场实验 、高架十字实验、Y迷宫、水迷宫等。
从最基础的基因型鉴定到高阶的功能验证，不同的分子实验对应着基因编辑小鼠研究的不同阶段。选对适配的实验方法，既能少走弯路节省时间成本，也能让你的实验结果严谨性直接拉满。下次再做基因编辑小鼠相关实验，对照这份清单梳理一遍，导师再也不用担心我的实验啦。
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上海南方模式生物科技股份有限公司（Shanghai Model Organisms Center, Inc.，简称"南模生物"），成立于2000年9月，是一家上交所科创板上市高科技生物公司（股票代码：688265），始终以编辑基因、解码生命为己任，专注于模式生物领域，打造了以基因修饰动物模型研发为核心，涵盖多物种模型构建、饲养繁育、表型分析、药物临床前评价等多个技术平台，致力于为全球高校、科研院所、制药企业等客户提供全方位、一体化的基因修饰动物模型产品解决方案。
