小鼠肝脏组织单细胞样本制备流程及步骤

1、将小鼠颈椎脱臼处死之后，用75%的酒精对小鼠表面进行消毒，使用手术剪剪开小鼠腹部皮肤并暴露腹腔；
2、取出小鼠肝脏并将肝脏组织转移至含有预冷1xPBS（abs962）缓冲液的培养皿中，清洗肝脏组织；
3、将清洗过的肝脏组织，剪碎成0.5-1 mm3左右的组织块

三、组织解离步骤

 

1、酶消化：将组织块（约100-200mg）转移至离心管，加入 1 mL 组织解离液（难消化可延长）。

2、摇床孵育：将离心管置于 37℃恒温水平摇床，以 80-100 rpm 的转速孵育 30-40分钟，每隔10 min可以手动颠倒离心管5-10次。
3、过滤与冲洗：将解离后的细胞悬液通过 70 μm 细胞筛网过滤至 50 mL 离心管，若有明显组织块，用 5 mL 注射器活塞研磨至无碎片；再用 3-5 mL 预冷 PBS 冲洗筛网，收集全部滤液。

2、Percoll密度梯度液配置（40%、70%、100%）
 

 

100% Percoll溶液：
Percoll细胞分离液与PBS缓冲液(10×)按体积比9:1混合，配制等渗100% Percoll母液
40% Percoll溶液
用100%的Percoll母液和RPMI-1640培养基按照体积比4:6混合，配置成40%等渗Percoll溶液。
70% Percoll溶液
用100%的Percoll母液和RPMI-1640培养基按照体积比7:3混合，配置成70%等渗Percoll溶液。
 

 

1、将上述得到的细胞悬液在4℃，400 g条件下离心5 min，弃去上清，使用4 mL 40% Percoll重悬细胞沉淀并转移至新的15 mL离心管中；
2、使用巴氏吸管吸取5 mL的70% Percoll溶液至装有4 mL 40% Percoll与细胞混合液的15 mL离心管底部形成密度梯度。
3、密度梯度离心：室温条件下，以 800 g 转速（升速 ACC 1、降速 DEC 0）离心 20 min。
4、细胞收集与洗涤：离心后吸取中间白膜层免疫细胞至新 15 mL 离心管，加入 3 倍体积 4℃预冷 1×PBS，上下颠倒混匀；4℃、400 g 离心 5 min，弃上清；再用 1 mL 1×PBS 重悬沉淀，4℃、400 g 离心 5 min，弃上清。
5、可选裂红处理：若需去除红细胞，向细胞沉淀中加入 1 mL 1× 红细胞裂解液，室温孵育 5 min；随后 4℃、400 g 离心 5 min，弃上清；重复步骤 4 的洗涤操作（1 mL 1×PBS 重悬 + 4℃ 400 g 离心 5 min 弃上清）。
6、终重悬：用适量 1×PBS 重悬细胞沉淀，所得细胞悬液用于后续实验。

四、流式结果展示
 

小鼠肝脏组织单细胞悬液染色结果（abs50091）
 

货号-规格	名称
abs50091-25T	小鼠肝脏组织解离试剂盒
abs50091-10T	小鼠肝脏组织解离试剂盒
abs7232-1箱	70um细胞筛网（200目，白色，底面过滤）
abs9101-100mL	红细胞裂解液（1×）
abs9102-100mL	细胞分离液
abs9475-500mL	细胞染色缓冲液
abs9484-500mL	RPMI 1640培养基（含L-谷氨酰胺，不含HEPES）
abs961-500mL	PBS缓冲液（10×）