小鼠体内中性粒细胞清除实验方法及注意事项
Ly-6G（淋巴细胞抗原6G）是小鼠中性粒细胞（Neutrophils）的核心表面标志物，分子量为21-25 kDa，属于Ly-6超家族的GPI锚定蛋白。Ly-6G在成熟中性粒细胞上高表达，是中性粒细胞研究的“分子标签”，在抗感染免疫、组织修复及肿瘤微环境等病理过程中发挥关键作用。
实验思路设计
结果说明
特殊注意事项
1、为了避免抗-Ly6G表位封闭（masking）带来的假阴性，用CD45做淋巴细胞圈门，排除 Siglec-F⁺（嗜酸性粒细胞）和 CD115⁺（单核细胞），用 Gr-1（RB6-8C5）⁺ / CD11b⁺圈门中性粒细胞
2、绝对计数：加入已知数量的微球乳胶珠（microsphere latex beads），计算“每5000个微球对应的中性粒细胞数量”
3、死活排除：肿瘤样本中加入 TO-PRO-3 染料排除死细胞
做了哪些平行比较 不同抗体的直接头对头比较：
鼠源化抗-Ly6G（25/100 μg） vs. 传统大鼠抗-Ly6G（50 μg） vs. PBS，均在同一老龄C57BL/6J（>20周，最抵抗品系）中进行。
不同剂量的纵向比较：25 μg（低） vs. 100 μg（高）的鼠源化抗体，观察清除持续时间差异（短效1周 vs. 长效4周）。
不同小鼠品系的普适性验证：C57BL/6J vs. Balb/c vs. NXG（T/B/NK缺、补体C5缺陷） vs. SCID（T/B缺）。
不同解剖位置的清除效率：外周血（循环池） vs. IMR32肿瘤微环境（组织浸润池），确认即使被招募到肿瘤内的中性粒细胞也能被彻底清除。
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实验思路设计
| 项目 | 实验详情 |
|---|---|
| 样本来源 | 正常小鼠&IMR32荷瘤SCID鼠 |
| 干预处理 | 使用抗体/对照清除体内中性粒细胞，观察功能变化 实验组：鼠源化抗‑Ly6G（克隆1A8，小鼠IgG2a），设置剂量梯度（25 μg、50 μg、100 μg）。 阳性对照组：传统大鼠抗‑Ly6G（Rat IgG2a，Bio X Cell），剂量50 μg或100 μg。 阴性对照组：PBS（溶剂对照） 在IMR32荷瘤SCID鼠中，给予IgA ch14.18抗体 + SIRPα‑D1融合蛋白（用于人为招募中性粒细胞入瘤），同时给予鼠源化抗‑Ly6G观察能否清除瘤内已聚集的细胞 |
| 检测方法 | 血液样本：通过面颊穿刺采血，收集于肝素锂管中，立即置于冰上（防止CD115（CSF1R）内化，确保单核细胞门控准确）。 肿瘤组织样本（IMR32荷瘤模型）：第70天处死后切除肿瘤，剪碎，使用小鼠肿瘤解离试剂盒进行标准化酶解消化，过70 μm细胞筛获得单细胞悬液。 流式分型检测+绝对计数 |
| 实验目的 | 将大鼠源抗‑Ly6G（IgG2a，仅能激活Fc依赖的缓慢清除）进行鼠源化改造为小鼠IgG2a同型。小鼠IgG2a是唯一能同时高亲和力结合所有活化性Fcγ受体（FcγRI/IV）并高效结合C1q（激活补体CDC）的同型，应能实现“三通路齐发”（ADCC+ADCP+CDC），达到高效、持久、单药单用的清除效果 |
结果说明
特殊注意事项
1、为了避免抗-Ly6G表位封闭（masking）带来的假阴性，用CD45做淋巴细胞圈门，排除 Siglec-F⁺（嗜酸性粒细胞）和 CD115⁺（单核细胞），用 Gr-1（RB6-8C5）⁺ / CD11b⁺圈门中性粒细胞
2、绝对计数：加入已知数量的微球乳胶珠（microsphere latex beads），计算“每5000个微球对应的中性粒细胞数量”
3、死活排除：肿瘤样本中加入 TO-PRO-3 染料排除死细胞
做了哪些平行比较 不同抗体的直接头对头比较：
鼠源化抗-Ly6G（25/100 μg） vs. 传统大鼠抗-Ly6G（50 μg） vs. PBS，均在同一老龄C57BL/6J（>20周，最抵抗品系）中进行。
不同剂量的纵向比较：25 μg（低） vs. 100 μg（高）的鼠源化抗体，观察清除持续时间差异（短效1周 vs. 长效4周）。
不同小鼠品系的普适性验证：C57BL/6J vs. Balb/c vs. NXG（T/B/NK缺、补体C5缺陷） vs. SCID（T/B缺）。
不同解剖位置的清除效率：外周血（循环池） vs. IMR32肿瘤微环境（组织浸润池），确认即使被招募到肿瘤内的中性粒细胞也能被彻底清除。
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| 产品分类 | 产品编号 | 名称 | 规格 |
|---|---|---|---|
| 功能性抗体 | S0B1198 | Invivo Anti‑mouse Ly6G monoclonal Antibody | 1/5/25/50/100 mg |
| 功能性抗体 | BE0075 | InVivoMAb anti‑mouse Ly6G | 1/5/25/50/100 mg |
| 同型对照 | S0B0787 | Invivo mouse IgG2a isotype control | 1/5/25/50/100 mg |
| 同型对照 | BE0089 | InVivoMAb rat IgG2a isotype control, anti‑trinitrophenol | 1/5/25/50/100 mg |
| 组织消化解离 | abs50090 | Mouse tumor tissue dissociation kit. | 10T/25T/50T |
| 筛网 | abs7232 | 70μm细胞筛网（200目，白色，底面过滤） | 50个/箱 |
| 流式鉴定：Panel 2 Monocyte Panel | ||||
|---|---|---|---|---|
| 靶点 | 荧光素 | 产品编号 | 名称 | 规格 |
| CD11b | FITC | S0B1808 | FITC Rat Anti‑Mouse/Human CD11b Antibody (M1/70) | 25T/50T/100T |
| GR‑1 | PE‑Cy7 | S0B8293 | PE‑Cy7 Rat Anti‑Mouse Ly‑6G/Ly‑6C (Gr‑1) Antibody (RB6‑8C5) | 25T/50T/100T |
| CD115 | APC | S0B8572 | APC Rat Anti‑Mouse CD115 Antibody (AFS98) | 25T/50T/100T |
| Ly‑6C | APC‑Cy7 | S0B5909 | APC‑Cy7 Rat Anti‑Mouse Ly‑6C Antibody (HK1.4) | 25T/50T/100T |
| Siglec‑F (CD170) | BV421 | 562681 | BD Horizon™ BV421 Rat Anti‑Mouse Siglec‑F | 25µg/50µg |
| CD45 | BV510 | 563891 | BD Horizon™ BV510 Rat Anti‑Mouse CD45 | 25µg/50µg |
| 流式鉴定：Panel 3 Lineage Panel | ||||
|---|---|---|---|---|
| 靶点 | 荧光素 | 产品编号 | 名称 | 规格 |
| CD3ε | PE | S0B1697 | PE Rat Anti‑Mouse CD3 Antibody (17A2) | 25T/50T/100T |
| NK1.1 | PerCP‑Cy5.5 | S0B8101 | PerCP‑Cy5.5 Mouse Anti‑Mouse NK1.1 Antibody (PK136) | 25T/50T/100T |
| B220/CD45R | PE‑Cy7 | S0B5262 | PE‑Cy7 Rat Anti‑Mouse CD45R/B220 Antibody (RA3‑6B2) | 25T/50T/100T |
| CD11b | APC | S0B5527 | APC Rat Anti‑Mouse/Human CD11b Antibody (M1/70) | 25T/50T/100T |
| Ly‑6C | APC‑Cy7 | S0B5909 | APC‑Cy7 Rat Anti‑Mouse Ly‑6C Antibody (HK1.4) | 25T/50T/100T |
| CD45 | Pacific Blue | S0B1655 | Pacific Blue Rat Anti‑Mouse CD45 Antibody (30‑F11) | 25T/50T/100T |
| GR‑1 | Pacific Orange | RM3030 | Ly‑6G/Ly‑6C Monoclonal Antibody (RB6‑8C5), Pacific Orange™ | 1mL |
