双光子活体成像技术用于观测小鼠脑内不同细胞自噬衰老差异
大脑作为高能耗器官，线粒体自噬是维持线粒体稳态的核心机制，但其在脑衰老过程中的细胞特异性动态变化，始终缺乏活体生理状态下的直接观测数据。本研究借助双光子活体成像技术与线粒体靶向mt-Keima荧光探针，在清醒雄性小鼠体感皮层中，分别定量检测神经元与星形胶质细胞的线粒体自噬水平，对比年轻与老年个体的差异，并验证NAD+前体烟酰胺核糖对衰老相关线粒体自噬下降的改善作用，为脑衰老的线粒体质量调控研究提供了活体层面的核心证据。
该研究由Beatriz Escobar-Doncel、Xiaoyi Zhang等学者共同完成，论文题为Two-photon in vivo imaging reveals cell type-specific mitophagy dynamic changes in mouse somatosensory cortex during aging，于2026年5月正式接收，发表于npj Aging期刊。
重要发现
01双光子mt-Keima成像的激发条件校准
mt-Keima是一种定位于线粒体的比率型荧光蛋白，其发色团的质子化状态随环境pH改变：中性条件下单光子激发峰约为440nm，酸性条件下红移至约590nm，发射波长均稳定在620nm，因此可通过荧光信号的变化特异性指示线粒体进入溶酶体的自噬降解进程。针对双光子激发下酸性环境的光学参数缺失、且双波长顺序扫描难以适配活体动态成像的技术难点，研究团队在稳定表达mt-Keima的细胞系中，对800nm至900nm区间的双光子激发效果进行系统测试，最终确定800nm为最优激发波长。该波长下酸性环境的mt-Keima荧光信号达到峰值，中性环境下信号强度极低，可最大程度富集功能性线粒体自噬溶酶体的有效信号，无需双波长比率成像即可实现活体层面的线粒体自噬水平半定量检测，为后续在体实验建立了稳定的技术基础。
为实现细胞特异性的线粒体自噬观测，研究采用重组腺相关病毒递送系统，分别利用SYN与GFAP启动子驱动mt-Keima在神经元与星形胶质细胞中特异性表达，定向注射至小鼠体感皮层第2/3层区域。待病毒表达稳定后，研究人员对头部固定的清醒自由活动小鼠进行双光子成像采集，通过基于监督机器学习的图像分割方法，对固定尺寸感兴趣区内的mt-Keima阳性信号进行定量统计。结果显示，与2-3月龄的年轻小鼠相比，18-20月龄的老年小鼠体感皮层内，神经元线粒体自噬水平下降约34%，星形胶质细胞下降约31%；同年龄组内，星形胶质细胞的线粒体自噬水平始终显著高于神经元，年轻组高出约31%，老年组高出约36%，表明两类细胞在衰老过程中遵循差异化的线粒体质量调控动态模式。
03衰老对线粒体超微结构的细胞特异性影响
为补充双光子成像的超微结构证据，研究结合透射电镜对同批次小鼠的体感皮层组织进行分析，分别对神经元胞体及血管旁星形胶质细胞终足内的自噬样结构、溶酶体、脂褐素颗粒与线粒体总数进行统计，并根据嵴结构完整性将线粒体分为健康、中间态与受损三个等级。结果显示，衰老过程中神经元内脂褐素显著累积，线粒体总数增加，健康线粒体占比下降、中间态线粒体占比上升，线粒体的面积与直径均出现增大；而星形胶质细胞终足内的线粒体总数与整体形态参数未随衰老出现显著改变，仅健康线粒体占比有所下降。无论年龄组别，星形胶质细胞终足内的线粒体在面积、直径与周长上均显著大于神经元内的线粒体，呈现出不依赖衰老进程的细胞类型特异性形态特征。
04烟酰胺核糖干预的线粒体自噬改善效应
研究进一步将双光子活体成像技术应用于药物干预效果评估，对完成基线成像的老年小鼠给予3周的烟酰胺核糖饮水干预，随后再次进行双光子成像检测。烟酰胺核糖是NAD+的关键前体物质，可通过提升细胞内NAD+水平，激活下游自噬与线粒体自噬相关通路。结果显示，干预后老年小鼠神经元内线粒体自噬水平提升56%，星形胶质细胞内提升19%，两类细胞的线粒体清除能力均得到显著增强。后续透射电镜分析显示，干预后星形胶质细胞终足内的中间态线粒体占比显著下降，神经元线粒体的面积与周长进一步增大，提示NAD+补充可在活体层面逆转衰老相关的脑内线粒体自噬衰退，且两类细胞呈现出不同的形态响应特征。
创新与亮点
本研究突破了既往脑线粒体自噬研究高度依赖离体固定组织、无法保留活体生理状态与动态调控信息的核心局限，建立了适配活体小鼠脑的单波长双光子mt-Keima成像方案。该方案通过优化激发波长，解决了双光子双波长扫描在清醒动物成像中操作难度大、时间分辨率不足的技术难点，同时结合细胞特异性启动子的病毒递送系统，首次实现了活体脑内神经元与星形胶质细胞两类细胞线粒体自噬水平的实时、精准定量检测。
该技术在光学生物医疗领域具备明确应用价值：在脑衰老与神经退行性疾病研究中，可实现同一动物的纵向活体监测，避免离体实验的生理背景丢失；在抗衰老药物筛选中，可直接在活体层面评估干预靶点的线粒体自噬激活效应，提升药效评价的生理相关性，为脑代谢相关疾病的机制研究与药物研发提供了全新的在体成像工具。
总结与展望
综上，本研究通过双光子活体成像证实，小鼠体感皮层的神经元与星形胶质细胞均存在衰老相关的线粒体自噬水平下降，且星形胶质细胞的基础自噬水平显著更高，NAD+前体烟酰胺核糖补充可有效逆转这一衰老相关衰退。未来可进一步拓展至性别差异、小胶质细胞等其他细胞类型及更多脑区的研究，结合线粒体功能检测与行为学评估明确线粒体自噬变化与脑功能衰退的关联，推动相关干预策略的转化应用。
声明：本文仅用作学术目的。
Escobar-Doncel B, Zhang X, Ljøstad Å, de la Puebla MF, Rao SB, Fjeldstad SA, Dahle MT, Amiry-Moghaddam M, Bjørås M, Fang EF, Tang W. Two-photon in vivo imaging reveals cell type-specific mitophagy dynamic changes in mouse somatosensory cortex during aging. NPJ Aging. 2026 May 26.
DOI:10.1038/s41514-026-00414-5.
