人 iPSC 标准化 EMT 成像体系揭示基底膜完整性调控细胞迁移时序机制
上皮-间质转化是多细胞生物发育与疾病进程中核心的细胞状态转换过程，但长期以来不同研究的模型体系与测量标准存在差异，阻碍了研究结论的横向比较与机制共识的形成。本研究以人诱导多能干细胞为基础，构建了二维集落与三维腔状体两种标准化培养体系，结合长时程活细胞成像与定量图像分析技术，从分子表达、细胞连接、胞外基质相互作用与功能表型多个维度同步解析上皮-间质转化的动态过程，揭示了培养几何形态通过基底膜完整性调控细胞迁移起始时间的核心机制，建立了一套可推广的细胞状态转换成像分析框架。
该研究由Caroline Hookway、Antoine Borensztejn、Leigh K. Harris等研究者完成，通讯作者为Caroline Hookway与Susanne M. Rafelski，论文题为A human induced pluripotent stem cell model for the holistic study of epithelial-to-mesenchymal transitions，于2026年发表于学术期刊Nature Methods。
重要发现
01多维度标准化的EMT成像模型体系构建
研究团队以人诱导多能干细胞为核心实验材料，构建了三种可重复的上皮-间质转化诱导体系，分别为基质胶包被基底上的二维集落、高粘附性PLF基质上的二维集落，以及预形成的三维上皮腔状体。所有体系均通过小分子抑制GSK3β激活Wnt信号通路诱导上皮-间质转化，同时验证了BMP4诱导方案的表型一致性，确保模型的可靠性与可推广性。为实现多模态成像观测，研究构建了6种内源性荧光标记的干细胞系，分别标记细胞核、干性转录因子、EMT相关转录因子、钙粘蛋白与紧密连接蛋白；同时采用人特异性IV型胶原荧光抗体标记细胞分泌的基底膜，可特异性区分细胞内源基底膜与小鼠来源的基质胶成分，排除外源性基质信号的干扰，为胞外基质动态的活体成像提供了高特异性标记基础。
研究建立了一套标准化的长时程活细胞延时成像方案，以30分钟为时间间隔对样本进行连续60小时的三维时序采集，每个时间点采集包含30个层面的Z-stack图像，完整覆盖细胞与基底膜的全部空间维度。成像同步采集明场通道、绿色荧光通道与远红光通道，可在同一样本中同时记录细胞整体形态、荧光标记分子的表达动态与基底膜的结构变化，实现多维度数据的精准时空配准。针对空气物镜与培养基间的折射率失配问题，研究采用校正系数对Z轴步长进行了修正，保障了三维成像的空间几何准确性。基于该标准化流程，研究最终产出了795组三维Z-stack活细胞延时视频、95组单平面活细胞视频与2648组固定细胞三维成像数据，所有数据均配套标准化元数据与标注。
在图像分析层面，研究开发了基于明场图像的深度学习全细胞分割算法，无需额外荧光标记即可生成三维全细胞掩码，适用于所有细胞系与实验条件，避免了荧光标记对细胞生理状态的潜在影响。在此基础上，研究建立了两套独立的迁移起始时间定量方法：其一为足迹面积法，通过提取细胞掩码最底部两层的投影面积变化，以面积快速上升前的拐点作为迁移起始时间；其二为基底膜内外核定位法，通过三维基底膜网格重建与细胞核实例分割，统计基底膜外侧细胞核比例的上升拐点判定迁移起始。两种方法经一致性验证结果高度吻合，确保了定量结果的稳健性。此外，研究还建立了针对荧光强度时序曲线的自动化特征提取方法，可精准识别分子表达的峰值时间、下降拐点与半最大下降时间，实现分子动态与功能表型的时序关联分析。
03基底膜完整性调控迁移起始的成像机制解析通过定量成像分析，研究发现三维腔状体体系中细胞迁移的起始时间显著晚于两种二维体系，而两种二维体系之间的迁移起始时间无显著差异，该规律在全部6种荧光标记细胞系中均稳定重现。针对分子标记的定量结果显示，不同EMT相关分子的表达动力学与培养几何的关联具有异质性，无法单独解释三维体系中迁移起始的延迟现象。
为进一步探究迁移延迟的机制，研究通过紧密连接蛋白的时序成像追踪细胞连接的重塑过程，发现在迁移起始前，二维与三维体系均会出现顶端连接网络收缩、细胞高度增加的现象，提示细胞脱层过程在两类体系中均已启动。但在二维体系中，细胞脱层与迁移起始几乎同步发生；而在三维体系中，细胞完成脱层后仍被完整的基底膜结构包裹，无法立即向外迁移，出现了细胞脱层与迁移表型的时间解耦。
功能扰动实验的成像结果进一步验证了基底膜的物理屏障作用：向培养基中加入IV型胶原酶降解基底膜，可剂量依赖性地提前三维体系的迁移起始时间；反之，加入广谱基质金属蛋白酶抑制剂阻断基底膜降解，可剂量依赖性地延迟迁移起始。高时间分辨率成像还捕捉到基底膜穿孔形成、细胞穿越孔洞的动态过程，直接证实基底膜的完整性是三维体系中EMT细胞迁移的关键限速步骤。
04EMT分子事件与功能表型的时空关联规律研究结合固定样本免疫荧光与活细胞荧光标记成像，系统定量了8种经典EMT标记蛋白的表达时序，结果显示多数标记的变化趋势符合经典EMT的特征，例如E-钙粘蛋白表达下调、N-钙粘蛋白表达上调，验证了模型的生物学有效性。同时成像结果也显示，不同培养体系的细胞初始状态存在差异：三维腔状体的初始E-钙粘蛋白表达水平更高，呈现更成熟的上皮状态；而二维集落的初始E-钙粘蛋白水平较低，在EMT诱导早期会出现一过性升高，与同期的新生腔状体形成过程时间重合，提示培养几何本身会影响细胞的上皮-间质状态基线。
通过同一样本内分子动态与迁移起始时间的配对关联分析，研究明确了不同分子事件与迁移功能的时序关系：E-钙粘蛋白表达的快速下调拐点略早于迁移起始，Eomes转录因子的表达峰值与迁移起始时间接近，Brachyury的表达峰值晚于迁移起始，而干性标记SOX-2的下调时间显著早于迁移起始且两者无相关性。该结果表明，单一分子标记无法准确代表EMT的功能进程，多维度成像测量是全面解析细胞状态转换的必要手段。
创新与亮点
本研究突破了传统EMT研究中模型体系不统一、测量维度单一、难以跨条件定量比较的成像技术瓶颈，首次在同一人源干细胞平台上实现了二维与三维体系下EMT的多模态、长时程、全定量成像分析。技术层面，研究开发了基于明场图像的深度学习三维细胞分割方法，无需荧光标记即可实现细胞区域的精准识别，降低了成像标记对细胞生理状态的干扰；同时建立了活体状态下基底膜三维结构动态的定量成像方案，实现了细胞与胞外基质相互作用的高时空分辨率观测。该成像分析框架可为发育生物学原肠运动研究、肿瘤转移机制研究以及EMT相关药物筛选提供标准化实验与定量平台，也为类器官、干细胞分化等领域的细胞状态转换研究提供了可复用的成像分析范式。
总结与展望
本研究建立了基于人诱导多能干细胞的标准化EMT成像研究体系，系统解析了培养几何形态对EMT动力学的调控规律，证实基底膜的物理屏障作用是三维体系中细胞迁移起始延迟的核心机制。研究产出的大规模标准化成像数据集与开源分析工具，可为领域内后续研究提供重要的方法与数据支撑。未来可基于该平台拓展基因扰动与药物筛选研究，结合更高分辨率的成像技术进一步解析细胞穿越基底膜的精细分子机制。
声明：本文仅用作学术目的。
Hookway C, Borensztejn A, Harris LK, Barszczewski T, Carlson S, Dalgin G, Mishra S, Adams EM, Dixon JC, Dupar RJ, Edmonds JH, Ehlers EA, Ferrante AJ, Fuqua MA, Gamlin CR, Garrison P, Gopalan J, Gregor BW, Hedayati MJ, Hurless VL, Klein KN, Leveille CL, Meharry SL, Mercado R, Morris HS, Nadarajan G, Nivedita N, Oluoch SA, Parent SE, Phan A, Roberts B, Samudre A, Sanchez EE, Sluzewski MF, Snyder LS, Thirstrup DJ, Thorp HF, Thottam JP, Torvi JR, Turman G, Viana MP, Wilhelm L, Wijesooriya CS, Yao J, Theriot JA, Gunawardane RN, Rafelski SM. A human induced pluripotent stem cell model for the holistic study of epithelial-to-mesenchymal transitions. Nat Methods. 2026 Jun 15.
DOI:10.1038/s41592-026-03096-9.
