慢病毒包装技术的核心原理与完整实验流程

慢病毒包装是借助宿主细胞组装复制缺陷型慢病毒颗粒，用于体外细胞、体内基因递送的常用分子实验技术，广泛应用基因敲入、沉默、过表达研究。

一、核心原理
依托三代四质粒系统，将目的基因、包装元件、包膜蛋白相关质粒共转染 293T 细胞，细胞内组装出具备侵染能力、无法自主复制的病毒颗粒，收集上清即可获得病毒原液。

维真生物采用的包装系统是2代包装系统，即三质粒系统，该系统包括1个包装质粒(psPAX2)、1 个包膜质粒(pMD2G)、1个目的基因质粒和1株包装细胞(293T cell)。下图是2代慢病毒包装系统的示意图：

二、慢病毒包装流程
1. 目的载体制备
以维真生物拥有目的基因 ORF 的 PENTER 现货克隆为例。利用维真生物的 ORF 穿梭质粒系统，将 ORF 片段从 PENTER 穿梭载体转移至慢病毒载体。

2. 细胞转染
将目的基因质粒和辅助质粒共转染到 HEK293T 细胞中。

3. 病毒收获
转染后约 72 h 离心收集细胞上清液，过滤并离心，得到非纯化的慢病毒液。

4. 纯化浓缩
采用蔗糖密度梯度超速离心法对收集到的慢病毒进行纯化，该方法利用不同颗粒之间存在的沉降系数差，在一定离心力作用下，颗粒各自以一定速度沉降，在密度梯度不同区域上形成区带。

5. 滴度检测
测定慢病毒滴度，确定有感染能力的慢病毒颗粒数目。维真生物采用孔稀释法进行慢病毒滴度标定。孔稀释法是通过数荧光的方法测定慢病毒滴度，得到的结果为有感染能力的慢病毒颗粒数。下图是维真某慢病毒(3.20×10^8TU/mL)孔稀释法测滴度时的荧光图：