包装腺相关病毒（AAV）的操作流程

维真生物采用的 AAV 包装系统为改良版的 AAV 无辅助病毒系统（AAV Helper-Free System），该系统包括载体质粒（含有目的基因表达盒，其两端是 AAV2 的反向末端重复序列）、包装质粒（反式提供具有 AAV 复制和包装功能的蛋白 Rep 和 Cap）、辅助质粒（含有辅助病毒 Ad5 的重要元件 E1a、E1b、 E2a、E4 等）和 1 株包装细胞（HEK293T cell）。

1、基因克隆

获取外源基因并将其构建至腺相关病毒载体。

2、病毒包装

将 携 带 外 源 基 因 的 重 组 质 粒 与 辅 助 质 粒 Ad Helper Vector 和 pAAV rep/cap Vector 共转染包装细胞 HEK293T ，转染 72h 后细胞内产生大量的重组病毒。

3、收毒

分别收获培养基上清与细胞沉淀，用 PEG8000 沉淀培养基上清中的病毒，裂解细胞沉淀收毒，合并从细胞沉淀和上清中得到的病毒。

4、纯化浓缩

碘克沙醇法对病毒进行纯化。碘克沙醇密度梯度离心，可以有效地将有感染力的病毒与空衣壳病毒及其他细胞杂质分离开，将有感染力的病毒由 10% 富集到 90% 以上。纯化完成后，再将收集到的病毒液置于超滤管中进行浓缩。

5、QC

① qPCR 法检测病毒滴度

② PCR 法检测病毒特异性

③ 银染法检测病毒纯度