蛋白 、抗体从头测序的常见问题解答

Q1:蛋白从头测序与Edman 降解法测序列有什么区别？

A:蛋白从头测序应用de novo从头测序算法，直接通过质谱谱图中的离子信息来推导肽段的序列。Edman 降解法一般适合15-20个氨基酸组成的肽段，且对于样品纯度要求也比较高，至少97%纯度以上；同时还要进行蛋白酶解、肽段分离纯化和肽段逐一上机测试，另外，对于一个单抗进行Edman降解测序的时间成本和经济成本也比较高。

与传统的Edman降解法相比。基于质谱的de novo从头测序更加高效率、高通量和低成本。在已知蛋白氨基酸序列的情况下，de novo从头测序还可以发现新的蛋白变体，这些变体可能来自于未知的突变，剪切拼接和各种翻译后修饰，为单抗序列提供更全面的信息。

Q2:蛋白从头测序的样品类型有哪些？

A:蛋白从头测序和蛋白的大小长度无关，单抗、Fab/Fc、双抗、多抗、重组蛋白、多肽、荧光标记抗体、交联抗体等均可以进行从头测序。

Q3:荧光标记或者交联抗体能够做从头测序吗？

A:蛋白交联在Beads上或者是荧光标记的蛋白如流式抗体FITC、Cyc5、PE等标记的抗体也是能够进行从头测序的。

Q4:蛋白从头测序的送样要求是什么？

A:蛋白从头测序标准的送样量是100ug，纯度是90%以上，有最低20ug测序成功的经验。蛋白纯度对测序结果的影响较大，杂的抗体蛋白、同源蛋白及BSA等会对样品测序产生干扰，从而影响实验结果。

Q5:样品buffer成分对测序结果有影响吗？

A:蛋白溶解缓冲液标准的送样建议是使用PBS或Tris缓冲液体系，此外如果有甘油、BSA、去垢剂、盐等成分，我们会有相应的方法做一些纯化处理，所以是不影响测序结果的。

Q6:样品糖基化和翻译后修饰会影响测序吗？

A:数据分析时会将可能的翻译后修饰和糖基化修饰考虑在内，不影响样品本身测序结果。

Q7:蛋白从头测序使用的仪器？

A:目前，我们使用的是赛默飞的三合一超高分辨质谱仪，型号为Orbitrap Fusion或者Orbitrap Eclipse。随着质谱技术的发展，百蓁技术平台将会陆续引进更多高端新仪器，为广大客户带来更优质的服务。

Q8:蛋白从头测序的报告内容？

A: ①完整的蛋白氨基酸序列，抗体包括重链和轻链序列，恒定区和可变区。

    ②完整分子量验证信息，将实际测得的分子量与理论序列分子量进行比对来验证序列的准确性。

    ③完整序列的肽段覆盖图，每个位点的氨基酸有超过十种不同的肽段支持。

    ④抗体可变区肽段的二级质谱图支撑。

    ⑤I/L鉴定的可信度分析。

Q9:蛋白从头测序结果的准确度如何？

 A:①测序结果保证全序列覆盖和100%序列准确，每个位点的氨基酸有超过十种不同的肽段支持，每个氨基酸在质谱图里有强的碎片离子峰证据。测序结果结合软件算法和人工检验，双重保证序列准确性。

   ②百蓁生物创始人李明院士是蛋白从头测序算法的主要发明人，PEAKS系列软件更是行业从头测序的金标准，百蓁生物母公司BSI在从头测序领域有20多年的经验积累，一直以来为国内外众多制药企业提供专业的测序服务，测序方法经得住时间的考验。

Q10:蛋白从头测序的周期是多久？

A: 符合送样要求，从开始检测到报告发送标准的服务周期是一周。