人源化小鼠对hPD1 CTLA4双特异性抗体的临床前影像学评价

文献信息
北京大学肿瘤医院暨北京市肿瘤防治研究所，核医学科，国家药监局放射性药物研究与评价重点实验室，恶性肿瘤发病机制及转化研究教育部重点实验室、贵州大学医学院等团队合作的研究成果Preclinical imaging evaluation of a bispecific antibody targeting hPD1/CTLA4 using humanized mice（人源化小鼠对hPD1/ CTLA4双特异性抗体的临床前影像学评价）在学术期刊《Biomedicine & Pharmacotherapy》发表。平生公司的小动物PET/CT（型号：Super Nova）产品在论文中提供了重要的肿瘤小鼠PET/CT图像和定量分析。

该研究的通讯作者为北肿杨志主任，朱华研究员。第一作者为侯兴国。

文献背景
背景:缺乏一种有效的方法来筛选对PD1/CTLA4靶向癌症治疗的免疫治疗挑战有反应的患者。免疫治疗效果不能通过外周血分析、组织基因标记或CT/MR值明确确定。在这里，作者使用放射性核素和成像技术在体内研究PD1/CTLA4阳性细胞中的新型双靶向抗体卡多尼利单抗(AK104)。

 方法:首先，人源化PD1/CTLA4小鼠在t细胞中表达hPD1/CTLA4。然后，在人源化小鼠中建立小鼠结肠癌MC38-hPD-L1细胞异种移植物。一种靶向PD1/CTLA4 (AK104)的双特异性抗体用放射性核素碘同位素标记。使用自主研发的双特异性单克隆抗体(mAb)探针¹²⁴IAK104进行免疫PET/CT成像，定位PD1+/CTLA4+肿瘤浸润T细胞并监测其在小鼠中的分布，以评估治疗效果。
 结果:成功构建的¹²⁴I-AK104双抗体具有理想的放射化学特性、体外稳定性和特异性。免疫PET结果显示，¹²⁴I-AK104在人源化小鼠中表现出高特异性的强hPD1/CTLA4阳性反应。¹²⁴I-AK104的高摄取不仅在肿瘤部位，而且在脾脏也被观察到。与PD1-或CTLA-4 -靶向mAb成像相比，¹²⁴I-AK104成像在肿瘤部位具有出色的标准摄取值，并且具有更高的肿瘤与非肿瘤(T/NT)比率。
 结论:本研究结果证明了将¹²⁴I-AK104转化为筛选免疫治疗获益患者的方法的潜力，并且通过人源化小鼠的免疫PET成像验证了该方法的有效性和可行性。

实验方法
动物模型
C57BL/6-Pdcd1^tm1(PDCD1)Ctla4^tm1(CTLA4)/Bcgen-MC38-hPD-L1小鼠用于免疫PET成像和免疫组织化学实验。B-hPD1/hCTLA4小鼠的基因靶向策略:在B-hPD1/hCTLA4小鼠中，编码lgV结构域的小鼠Pdcd1基因外显子2被人Pdcd1外显子2取代。在B-hPD1/hCTLA4小鼠中，编码细胞外结构域的小鼠Ctla4基因外显子2被人Ctla4外显子2取代。在4-6周龄雌性B-hPD1/ hCTLA4小鼠中建立MC38-hPD-L1异种移植物(MC38细胞经基因修饰表达人PD-L1，命名为MC38-hPD-L1)。简单地说，在MC38-hPD-L1细胞中，小鼠Pdl1基因被人类PD-L1编码序列所取代。插入外源启动子和人PD-L1编码序列，替换部分小鼠外显子3。插入破坏内源性小鼠Pdl1基因，导致无功能转录。将PBS重悬的MC38-hPD-L1细胞以5×105细胞/0.1 mL的体积接种于B-hPD1/hCTLA4人源化小鼠右侧皮下)。

 Micro-CT
正常KM小鼠和B-hPD1/hCTLA4-MC38-hPD-L1小鼠通过尾静脉注射3.7 MBq的¹²⁴I-AK104/AK105/抗CTLA4 (n=3)。所有小鼠在注射放射性标记抗体72小时前在其饮用水中给予0.5%碘化钾溶液，以阻断甲状腺的生理摄取。然后在注射后2、24、96和192 h (p.i)每个时间点进行10 min静态PET扫描。使用小动物PET/CT扫描仪(Super Nova PET/CT, 平生医疗科技有限公司)，通过Avatar 3重建PET图像，并通过绘制这些器官的ROI来计算感兴趣区域(ROI)衍生的标准摄取值(SUV)。

实验结果
在不同的时间点(2、24、96和192 h)，通过勾画免疫图像PET的ROI，获得B-hPD1/hCTLA4-MC38-hPD-L1小鼠几个器官的SUVmax数据(图4A和B)。值得注意的是，¹²⁴I-AK104的肿瘤摄取在注射后24小时达到峰值，然后下降(图4B)。成像小鼠生物分布实验结果与成像结果一致(图4C)。作者在小鼠成像后进行了生物分布实验，发现这三种探针主要分布在脾脏，这主要是因为T细胞是由脾脏产生的。除脾脏外，AK104在肿瘤部位大量富集。虽然CTLA4单克隆抗体在肿瘤部位摄取明显，但在非肿瘤部位也有较高的摄取。在非肿瘤部位未发现AK105的显著富集。此外，¹²⁴I-AK104组的T/NT比率高于其他组(图4D)。

图4 ¹²⁴I-AK104、¹²⁴I-AK105和¹²⁴I-anti-CTLA4治疗MC38-hPD-L1荷瘤小鼠的免疫PET成像分析(A)三组小鼠在2,24,96和192 h的免疫PET/CT图像。(B)不同组小鼠在2,24,96和192 h的解剖器官SUVmax。(C)尾静脉注射后192 h B-hPD-1/hCTLA4-MC38-hPD-L1小鼠体内¹²⁴IAK104、¹²⁴I-AK105和¹²⁴I-anti-CTLA4的生物分布。(D)尾静脉注射192 h后T/NT。

文献结论
总之，作者的研究通过成像方法证明了PD1/CTLA4-阳性浸润T细胞在人源化小鼠肿瘤部位的存在。作者的研究结果表明，这种方法可以用于识别可能受益于免疫治疗的患者，并监测治疗的有效性。此外，作者发现¹²⁴I-AK104的摄取与PD1/CTLA4的表达水平相关，这一点通过人源化小鼠和PD1/CTLA4 IHC的SUVmax分析得到了证实。本研究的方法和结论可为免疫治疗反应监测的临床前研究提供依据。

使用设备

Super Nova^® Micro PET/CT（III 代外观图）