T7共转录加帽试剂盒应用与特点
T7共转录加帽试剂盒应用：
体外RNA合成
T7共转录加帽试剂盒产品特点:
1)一步法化学加帽 一步到位，合成结束，可直接纯化
2)严格的质量管理规范 无残留
3)产生的mRNA活性更高
质量控制：
纯度≥95%，宿主DNA残留≤100pg/mg，宿主蛋白残留≤50ppm，内毒素残留≤10EU/mg，无RNA酶、核酸内切酶、核酸外切酶、蛋白酶残留，无菌，无病原体。
反应体系（仅供参考）：
| 组分 | 体积（uL） | 终浓度 |
| T7 RNA Polymerase Mix | 2 | - |
| 10×Transcription Buffer | 2 | 1× |
| CTP / GTP/ ATP/ UTP (100 mM each) | 2 each | 10 mM each |
| Template DNA | 1 µg | - |
| RNase free H2O | Up to 20 | - |
注意:反应在室温下进行，由于10×转录缓冲液中含有亚精胺，亚精胺浓度过高会导致DNA模板在低温下沉淀。
备注:
1. 注意不要在反应系统中混入RNase。
2. 实验设备(如:移液器尖端、产品管等)应严格使用RNase Free产品。
3.为了您的安全与健康，请穿白大褂，戴一次性手套。
4. 仅供研究使用!
常见问题解答：
1. 转录产量低
模板的质量与成品率密切相关。试验组的产量显著低于对照组，可能的原因有:①实验模板含有抑制成分;模板有问题。
建议:①重新纯化模板;②确定模板定量及其完整性;③延长反应时间;④增加模板输入量;⑤尝试其他启动子和RNA聚合酶。
2. 短转录产量低
短转录起始片段会抑制该反应。当转录产物小于100 nt时，延长反应时间至4-8 hs或增加模板量至2 μg均可提高RNA产量。
3.RNA转录长度大于预期
如果电泳显示产物条带大于预期条带，可能的原因是:①质粒模板可能没有完全线性化;②感觉链3’端结构突出;③RNA具有未完全变性的二级结构。
建议:①检查模板是否完全线性化，必要时进行额外线性化;②选择合适的限制性内切酶，避免3'外翻，或使用Klenow Fragment /T4 DNA聚合酶完成转录后再继续;③用变性凝胶检测RNA产物。
4. RNA转录长度低于预期
如果电泳显示产物条带小于预期大小，可能的原因是:①模板中含有类似于T7 RNA聚合酶的终止序列;②模板中GC含量较高。
建议:①降低反应温度(如30℃)。有时降低温度可以增加转录长度，但会降低产量。或者尝试不同的RNA聚合酶进行转录;②若模板GC含量较高，可采用42℃转录，或添加SSB以增加产量和转录长度。
5. 转录产物的电泳跟踪
电泳过程中出现拖尾现象。可能原因:①实验操作过程中被RNase污染;②RNase污染DNA模板。
建议:①使用不含RNase的移液针尖和EP管，佩戴一次性乳胶手套和口罩，所有试剂均使用不含RNase的H2O制备。②重新纯化模板DNA。
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