利用小型有机染料纳米团簇提升 NIR-II 成像引导的手术效果
本文要点：通过荧光引导手术（FGS），可以大大提高实体瘤患者的手术准确性。然而，现有的FGS技术由于其低穿透深度和灵敏度/选择性而存在局限性，这在相对较短的成像窗口（<900 nm）中尤为普遍。使用近红外二区（NIR-II）FGS，通过在长成像窗口（>900 nm）下的低自发荧光和散射，可以有效解决这些问题。然而，有机染料固有的自组装性导致材料在主要器官大量积累，导致明显的背景信号和潜在的长期毒性。
本文基于供体-受体-供体的染料的供体结构，以控制自组装过程。最终控制形成超小染料纳米团簇，从而促进肾脏排泄并最大限度地减少背景信号。该染料纳米团簇不仅可以显示清晰的血管成像、肿瘤和肿瘤前哨淋巴结的定位，还可以实现肿瘤阳性前哨淋巴结的高性能NIR-II成像引导手术。通过这项研究表明，基于染料纳米团簇的 NIR-II FGS 显着改善了根治性淋巴结清扫术的结果。
这项研究的目标是通过合理地设计供体结构，来控制S-D-A-D-S染料的组装过程。研究结果表明，将己基叔（乙二醇）链连接到呋喃供体会导致 S-D-A-D-S 染料组装成小的纳米团簇。这些染料纳米团簇可以通过肾脏迅速排泄，并且不会积聚在肝脏和骨髓等免疫器官中。染料纳米团簇提供高性能的NIR-II血管造影和淋巴造影。它们还能够实现高性能的 NIR-II 成像引导手术，使肿瘤相邻的前哨淋巴结通过光学成像进行区分，从而显着改善小鼠模型中原位乳腺癌肿瘤手术的结果（图 1）。该方法可以克服 FGS 近红外 II 探针的局限性，并为更有效和准确的成像引导手术干预铺平道路。
图1. 具有肾脏排泄特性的NIR-II BFC6TP 纳米团簇，可实现高性能NIR-II 成像引导手术以及淋巴结（LN）、血管和肿瘤成像。
S-D-A-D-S 染料可控地自组装成纳米团簇及其体内药代动力学
该研究合成了两个用于 NIR-II 成像的明亮探针，分别命名为 BFC6P 和 BFC6TP，它们与两条 1.5 kDa 的聚乙二醇 （PEG） 链偶联（如图2a，b）。BFC6P和BFC6TP在约730 nm处具有吸收峰，并具有约为1050 nm的NIR-II荧光发射（图1）。2c， d）。当溶解在水溶液中时，S-D-A-D-S染料可以自发组装成纳米颗粒。研究发现，将屏蔽单元从芴改为苯会导致自组装染料纳米团簇形成的尺寸减小，导致药代动力学从肝胆向肾脏排泄发生变化。在这项研究中，将供体单元从己基呋喃（BFC6P）替换为己基叔（乙二醇）呋喃（BFC6TP），这导致染料纳米团簇的尺寸进一步减小（图2e-j）。DLS测得的水合直径BFC6TP和BFC6P的水合直径分别为40.1 nm±8.6 nm和84.7 ± 24.2 nm，而100 k超滤后的粒径分别为2.9 ± 1.4 nm和3.2 ± 0.2 nm。然而，分子的聚集行为受多种因素的影响，如浓度、溶出缓冲液和温度，但在所有的体外测量中，BFC6TP纳米团簇的尺寸始终小于BFC6P纳米团簇的尺寸。这进一步证明了BFC6TP的设计有效。
图2. S-D-A-D-S染料可控地自组装成染料纳米团簇，而供体工程提供了一种控制自组装过程的策略，从而形成超小染料纳米团簇。
体外细胞毒性和细胞成像测试证明，我们的染料具有良好的生物相容性和成像能力。然后，研究了小鼠静脉注射BFC6TP纳米团簇后BFC6TP纳米团簇的体内药代动力学。在前5分钟内，在膀胱中检测到强荧光信号，而在肝脏中观察到弱荧光信号（图2k）。与BFC6P纳米团簇相比，BFC6TP纳米团簇表现出更快的肾脏清除率和更低的肝脏蓄积（图2 l）。在药代动力学实验期间，观察到荧光信号随时间推移而耗尽，在 24 小时时间点几乎消失。此外，从PBS过渡到FBS时观察到的两种染料纳米团簇的尺寸变化表明，两种类型的纳米团簇都表现出分解行为。然而，与BFC6TP相比，BFC6P保持了更大的尺寸，这可归因于BFC6P内供体上的烷基链导致疏水性增加。这导致肝脏中的保留更大，因此肝脏和肾脏清除率减慢（图S8）。总的来说，BFC6TP纳米团簇的低器官积累提供了更好的成像对比度，快速的肾脏排泄有助于整体生物安全性，使其非常适合NIR-II成像和成像引导手术（图2m）。
BFC6TP纳米团簇可实现高性能的NIR-II血管造影、淋巴造影和肿瘤成像
BFC6TP纳米团簇在相对较短的成像窗口内提供高性能的NIR-II血管造影。这对于需要重复影像学的生物事件或病变部位极为重要，因为相对较短的影像学窗口具有最小的背景信号和高影像学对比度。在将BFC6TP纳米团簇静脉注射到脱毛的Balb / c小鼠中后，后肢血管逐渐变得可见，在NIR-II成像期间，动脉和静脉血管在选定的时间点均可区分，显示出显着的成像对比度（图3a， b）。五个选定感兴趣区域的血管与肌肉的比率均高于 2（图 4c）。在较长的亚NIR-II窗口下成像进一步增强了成像对比度，导致大脑和后肢的血管与肌肉比增加（图3d 和 e）。
图3 BFC6TP纳米团簇可实现高性能的NIR-II血管造影、淋巴造影、成像引导手术和肿瘤成像。
BFC6TP纳米团簇还支持高性能的NIR-II淋巴造影和成像引导手术。脚垫注射BFC6TP纳米团簇后，NIR-II淋巴造影显示前哨淋巴结清晰（图3f）。瘤内注射BFC6TP纳米团簇后，绘制了时间依赖性LN与肌肉和肿瘤与肌肉的比率（图3g，h）显示前哨LN可以清晰地可视化。因此，BFC6TP纳米团簇有助于通过NIR-II成像引导手术精确切除肿瘤浸润性前哨LN。BFC6TP纳米团簇还提供了位于小鼠乳房的远端淋巴结和远端肿瘤的成像。BFC6TP纳米团簇被发现沿着淋巴系统迁移到肿瘤，因此对于癌症手术期间的术中肿瘤可视化至关重要。在患有乳腺异种移植 4T1 肿瘤的小鼠尾部附近皮内注射 BFC6TP 纳米团簇后，探针照亮了前哨淋巴结 （SLN） 和淋巴管系统，随着时间的推移逐渐出现强烈的肿瘤信号（图3i）。这表明随着时间的推移，探针可以从注射部位迁移到 SLN、更高级别的淋巴结和远端肿瘤。在尾部碱基注射后24小时内，肿瘤和SLNs保持高度分离，荧光强度相对较高（图1）。4J）。此外，将BFC6TP纳米簇静脉注射到4T1荷瘤小鼠中可提高NIR-II肿瘤成像能力，在注射后9小时内出现肿瘤中的最大信号积累（图3k）。循环24 h后，4T1肿瘤中仍有高信号（图3l），表明BFC6TP纳米团簇在内部原发肿瘤被动靶向方面的潜在应用。同时识别肿瘤和肿瘤引流 SLN 的能力对各种癌症（包括乳腺癌和皮肤黑色素瘤）的非侵入性诊断和影像学引导手术具有重要意义。
BFC6TP纳米团簇术中NIR-II成像引导手术有效抑制肿瘤转移
为了实现SLNs的精确图像引导切除并抑制肿瘤复发，在4T1荷瘤小鼠中进行~25 μL BFC6TP（350 μM）纳米团簇的肿瘤内注射，以对SLNs进行成像。建立具有原位乳腺癌模型的小鼠，并将其随机分为四组：未治疗组（第 1 组，对照组）、SLN 切除组（第 2 组）、肿瘤切除组（第 3 组）和 SLN 和肿瘤均被切除的组（第 4 组）。在高分辨率NIR-II成像下，胸肱淋巴结的肿瘤邻近SLN从周围组织精确可见。NIR-II 成像引导手术是通过切除 SLN、肿瘤或两者的组合进行的，然后仔细缝合伤口。在实验期间每天监测四组小鼠的肿瘤体积和体重。37天后，处死小鼠，并评估离体肿瘤转移的抑制作用（图4a）。手术切除原发肿瘤或SLNs可以通过中断肿瘤转移途径显着延长小鼠的存活时间。总体而言，原发肿瘤和SLN切除的第4组对肿瘤复发和转移的抑制效果最好。
图4. 术中NIR-II成像引导的肿瘤/肿瘤邻近SLNs切除可有效抑制肿瘤转移。a 描述动物实验的设计和工作流程的方案
结论：
综上所述，荧光引导手术（FGS）是一种很有前途的提高实体瘤患者手术准确性的技术。然而，目前FGS技术的局限性促使研究人员开发了NIR-II FGS，它受益于低自发荧光和长成像窗口下的散射。NIR-II FGS 可以在工作灯下进行，为此开发理想的 NIR-II 探针很有希望。屏蔽单元-供体-受体-供体-屏蔽单元（S-D-A-D-S）染料已被开发为一种高度稳定的NIR-II探针，但它们的自组装导致在主要器官中积累，导致明显的背景信号和潜在的长期毒性。本研究优化了S-D-A-D-S染料的供体结构，形成超小染料纳米团簇，促进肾脏排泄，最小化背景信号。基于S-D-A-D-S染料纳米团簇的NIR-II FGS，大大实现了高性能的NIR-II成像引导手术，并改善了根治性淋巴结清扫术的结果，使肿瘤邻近的前哨淋巴结具有光学可辨别性，从而显着改善了肿瘤手术的结果。我们证明，精确切除原发肿瘤和肿瘤浸润性 SLN 对于预防癌症转移是必要的，尤其是对于深部组织的原发性癌。切除淋巴系统显着减少肿瘤转移途径，从而减少肺部和其他器官的转移性病变。本研究中的方法代表了一种有前途的方法，可以克服 FGS 近红外 II 探针的局限性。
基于ICG的红外成像程序在数十万患者中广泛进行，利用NIR-II窗口的优势可以提高其临床结果。然而，已知ICG具有高度不稳定性。因此，开发具有超稳定成像能力的D-A-D染料将为该领域做出重大贡献。了解 S-D-A-D-S 染料的固有组装机制对于促进其临床转化至关重要，因为理想的探针应在成像后及时从体内排出。此外，NIR-II/PET 双模成像探头的未来发展将为癌症患者带来显著的益处。这些探头不仅可以为放射治疗提供增强的成像引导，还可以使用手术机器人进行后续的成像引导手术。这种在单个探针中集成多种功能对于提高癌症治疗的精确度和有效性具有巨大的前景。
参考文献
Wang, Y., Zhou, D., Ma, H. et al. An ultra-small organic dye nanocluster for enhancing NIR-II imaging-guided surgery outcomes. Eur J Nucl Med Mol Imaging (2024).
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