活细胞成像应用于斑马鱼的观察

    斑马鱼与小鼠一样，是一种著名的动物模型，广泛应用于表观遗传学、毒理学、临床研究、神经科学等生物学研究。这主要是因为斑马鱼的胚胎和幼体易于遗传操作，而且它们体积小，光学清晰度高，易于用光学显微镜观察。

 

图1 利用斑马鱼在药物筛选中观察生物体表型^[1]

 

图2 药物筛选、自动成像以及斑马鱼幼体分析^[2] 

    Celloger^® Mini Plus提供了一个自动生成多层图像的Z-stacking功能，Celloger^®分析软件提供了一个合并功能，可以轻松地组合多层荧光图像。这些功能使研究人员能够在单个图像中观察三维(3D)结构。通过功能表达绿色荧光蛋白(GFP)观察转基因斑马鱼(幼鱼)，详见下面的步骤1和2。

 

图3 Celloger^® Mini Plus设备图
 

应用实例：

步骤1，Z-stacking

    如由细胞组成的组织，根据焦点可以提供各种信息，因此确定各种焦点是至关重要的。通过设置层与层之间的距离(“Step”)和拍摄的图像数量(“N,N”)，使用Celloger®MiniPlus可以在设置位置(Z位置)的上方和下方以固定的间隔(“Step”)生成多层图像(图4)。每个观察点可以输入不同的设置，并且可以在不同的观察点执行不同的Z-stacking设置。

 

图4 Z-stacking

    我们使用Celloger^® MiniPlus来创建转基因斑马鱼的Z-stacking图像。由于3D幼鱼的每个部分可接受的焦平面不同，我们通过操纵自动移动的Z轴来验证合适的焦平面。我们在多个焦平面中识别出了上焦平面(Z=4.585)和下焦平面(Z=4.685)，并将中间对应的坐标(Z=4.635)设置为扫描位置；并且以扫描位置为中心，在位置的上方和下方各设置以10µm间隔拍摄5张照片(图5)。

 

图5 斑马鱼幼鱼拍摄过程

    图6显示了斑马鱼的上、中、下焦平面拍摄的照片。侧视图下焦平面头部形状清晰，上焦平面腹侧部清晰可见。

 

图6 斑马鱼拍摄结果

步骤2，Z-projection

    多层成像(Z-stacking)是观测三维模型的必要手段。然而，解释多层成像获得的多幅图像的结果是费力和耗时的。Z-projection函数将多个图层合并为一幅图像，使一个3D样本可以作为一幅图像被清晰完整地观察到，增加了研究人员的洞察力。

    Z-projection类型是对位于每个X-Y位置的多个Z坐标进行积分的方法。“Maximum”用于整合几个Z坐标点中最亮的像素，而“Average”用于计算几个Z坐标点的平均亮度(图7)。此外，在Celloger^®分析软件中添加了可以增强的元素“add deviation value”，以获得更清晰的图像。

 

图7 Z-projection类型 

    在Celloger^®分析软件中打开Z-stacking拍摄的图像，点击Z-stack选项卡上的“merge”按钮，可以得到Z-projection图像(图8)。不同的样本对应的Z-projection类型不同，建议对每种类型进行确认。

 

图8 Z-projection过程 

    图9显示了通过选择“maximum”类型和“add deviation value”选项拼接三幅图像进行投影的结果。在底部焦平面上清晰地表达了头部结构，在顶部焦平面上可以观察到的独特的腹侧形状，使用投影函数将其表达为单个图像。

 

图9 结果图

    我们使用Celloger^® Mini Plus系统成功获得了斑马鱼的高质量荧光图像。将三维结构的多层信息成功地组合并清晰地表达在一张图像中。该实验证实了使用各种其他样品类型捕获3D图像的可行性，包括球体和类器官，这可以扩大研究人员可用的研究范围。
 

结语：

    斑马鱼作为一种广泛使用的动物模型，用于神经系统疾病、药物筛选和表观遗传学等研究模型，具有完全表征的基因组，并且与人类表现出高度的遗传同源性。作为一种易于遗传改造及使用的模型，大量的细胞荧光报告基因和尖端成像技术更加推进了斑马鱼在模型方面的潜力。Celloger^®活细胞成像设备无需反复拿取细胞样本，在培养箱内即可实现对细胞的可视化以及进行长期动力学测定。利用延时成像技术及Z-stacking功能，获得更清晰的3D荧光成像效果。随着系统研究的推进和斑马鱼成像效果的提升，这种模式生物可能会继续在多种研究领域发挥关键作用。

 

 

 

参考文献：

[1] Rosa JGS, Lima C, Lopes-Ferreira M. Zebrafish Larvae Behavior Models as a Tool for Drug Screenings and Pre-Clinical Trials: A Review. Int J Mol Sci. 2022 Jun 14;23(12):6647. 

[2] Chia K, Klingseisen A, Sieger D, Priller J. Zebrafish as a model organism for neurodegenerative disease. Front Mol Neurosci. 2022 Oct 13;15:940484.