活细胞成像用于细胞毒性的研究
从广义的角度来说，“细胞毒性”是指某种物质对活细胞产生的不健康影响。这种影响可能是指细胞在附着、形态、结构完整性、生长、新陈代谢或增殖等方面的不利变化，这些变化可能最终导致细胞丧失活力（死亡）[1]。细胞毒性可通过测量毒性效应本身（细胞毒性测定）或其对细胞活力的影响（活力测定）来确定。活力测定实际上是对存活细胞数量的量化，与细胞毒性检测（测量细胞死亡或破坏）中获得的测量结果成反比 [2、3、4]。
常用的细胞毒性实验测定一系列的终点指标，如细胞膜破裂后乳酸脱氢酶（LDH）和活性氧（ROS）的产生，线粒体膜电位的损伤等。通过细胞毒性实验测定细胞毒性对药物开发与生物研究至关重要。然而，大多数细胞毒性实验都是在终点测量的，因此很难研究细胞对药物或化合物的动态反应。动态活细胞成像与传统的终点测试方法不同，可以通过延时记录分析细胞死亡随时间的依赖性变化。
Celloger®系列是一款活细胞成像设备，可以在培养箱中同时进行明场和荧光成像（图2）。该系统有一个全自动摄像头，可以在用户设定的时间间隔内对不同位置进行成像。通过使用分析软件计算捕获图像的融合度（%），可获得随时间变化的融合度（%）图。此外，通过测量荧光覆盖率与荧光强度，可用于分析细胞死亡的发生情况，用以判定细胞毒性。
图2 Celloger®系列产品
Celloger活细胞成像产品应用：一、Celloger® Mini Plus与CellTox™ Green Dye相结合用于监测Nocodazole的细胞毒性
CellTox™ Green Dye荧光染料可用于检测由于细胞死亡引起的细胞膜完整性变化，它无法进入活细胞，但可以进入受损细胞使得受损细胞的荧光显著增强。荧光信号强度可以作为细胞毒性的定量指标，且荧光信号值变化与细胞毒性成正比例相关。该染料可用于检测长时间药物处理期间以及用于终点法检测药物处理后的细胞毒性作用。
HeLa细胞按1×104个/孔的细胞量进行48孔板的细胞种板。种板培养过夜后，用不同浓度的抗癌药物Nocodazole( 6.625 nM、31.25 nM、62.5 nM、125 nM、250 nM ) 处理细胞。此时，在样品中加入CellTox™ Green Dye ( Promega，GB742 )，该染料可与细胞死亡过程中膜完整性受损的细胞的DNA结合。使用安装在培养箱内的Celloger® Mini Plus在48小时内每隔1小时采集一次细胞图像，然后使用分析软件对图像进行分析。细胞死亡率(%)=荧光覆盖率（死亡细胞）/明场融合度（总细胞）。
实验结果表明用不同浓度的Nocodazole处理细胞并进行延时成像，细胞形态呈浓度依赖性变化，在明场视野下观察到细胞融合度减小（图3A，B）。此外，用CellTox™染料对死亡细胞进行荧光成像并量化，结果显示荧光细胞的比例随着细胞凋亡而增加（图3C）。
图3A 各浓度Nocodazole的明场与荧光视野图像
（图像显示以24h为间隔时间，绿色荧光表示死亡细胞。比例尺，200 μm）
图3B 细胞随时间变化的融合率（%）数据图
图3C 细胞死亡率（%）的数据图
二、Celloger® Nano监测细胞毒性
用红色荧光染料对死亡细胞进行染色，来测量细胞毒性。死亡细胞的细胞膜高度受损，因此可以在细胞结构中看到红色荧光。使用Celloger® Nano监测HeLa细胞的细胞毒性，间隔拍摄时间为1小时，总记录时长71小时。红色荧光表示细胞死亡（图4）。
图4 细胞毒性监测（A）仍然有一部分活细胞，（B）大部分都是死细胞（红色荧光）
后续我们将为您继续介绍活细胞成像系统在不同研究下的应用实例，敬请关注。
参考文献：
[1] Eisenbrand, G.; Pool-Zobel, B.; Baker, V.; Balls, M.; Blaauboer, B.; Boobis, A.; Carere, A.; Kevekordes, S.; Lhuguenot, J.-C.; Piet-ers, R. Methods of in Vitro Toxicology. Food Chem. Toxicol., 2002, 40(2), 193-236.
[2] Freshney, R.I. Culture of Animal Cells : A Manual of Basic Tech-nique. 4th ed. Wiley: New York, 2000.
[3] Niles, A.L.; Moravec, R.A.; Riss, T.L. Update on in Vitro Cytotox-icity Assays for Drug Development. Expert Opin. Drug Discov., 2008, 3(6), 655-669.
[4] Miret, S.; De Groene, E.M.; Klaffke, W. Comparison of in Vitro Assays of Cellular Toxicity in the Human Hepatic Cell Line Hepg2. J. Biomol. Scr., 2006, 11(2), 184-193.
