μ 型Opium受体激动剂助力Fentanyl结构的类似物设计
副作用限制临床应用
Opioids是治疗急性和慢性疼痛的最有效药物。分别作为具有代表性的Opium类生物碱和合成Opioids，Morphine和Fentanyl被用于癌痛治疗、麻醉镇痛、预防性镇痛以及术后多模式镇痛。虽然Opioids是有效的止痛药，但它们会导致严重的副作用，如呼吸抑制 (呼吸抑制所导致的死亡引发了广泛传播的 “Opioids危机”[1,2]，尤其是在北美)、成瘾和便秘，从而限制了它们的临床应用。
根据 2019 年发布的报告，超过 70% 的“Opioids危机”死亡是合成Opioids (主要是Fentanyl及其衍生物) 过量使用所致。这些副作用限制了Opioids在临床的应用。
Opioids的功能由四种 G 蛋白偶联受体 (GPCRs) 家族介导，即 μ、κ、δ 和伤害感受肽受体 (NOPR)，在这些Opium受体中，μ 型Opium受体 (μOR) 被发现是镇痛和副作用的主要受体。有研究指出，Opium样物质诱导的镇痛作用归因于 μOR 的 Gi 蛋白信号转导 (图 1)，然而，其副作用 (呼吸抑制等) 究竟是由哪个信号通路产生，目前存在争议：一种观点认为由 β-arrestin 信号转导引起，另一观点认为与 G 蛋白门控的内向整流钾通道 (GIRK) 的信号转导有关。
图 1. Fentanyl和Morphine诱导的 μOR 信号传递和潜在的药理作用[1]
今年 11 月，Cell 在线发表了题为 Molecular recognition of morphine and fentanyl by the human μ-opioid receptor 的研究性论文。这篇文章阐述了Fentanyl、Morphine和其他 μOR 激动剂与 μOR 的结合方式，并揭示了它们与受体结合的关键差异。该研究还揭示了Fentanyl和Morphine对 μOR 的 β-arrestin 蛋白活性起重要作用的结构因素，并为设计有效的、可能更安全的镇痛剂提供了结构模板[1]。
■ Fentanyl和Morphine如何进行信号转导？
该研究首先表征了研究中使用的六种具有不同化学骨架的Opioids——Fentanyl、Morphine、SR17018、TRV130、PZM21 和 DAMGO(一种拟肽激动剂，可激活 μOR-Gi 复合物，作为对照)——的信号转导情况。
如果所示 (图 2a)，所有五个配体都能激活 μOR，以抑制 cAMP 的产生，Fentanyl、Morphine和 PZM21 是完全激动剂，而 SR17018 和 TRV130 是部分激动剂。
在 β-arrestin 招募测定中没有检测到 PZM21 的反应信号，而对 SR17018 和 TRV130 只产生微弱的信号。相比之下，Morphine和Fentanyl都能诱导强大的 β-arrestin 招募 (图 2b)。总而言之，Fentanyl和Morphine不仅能完全激活 μOR，还可诱导强大的 β-arrestin 招募。
图 2. Opium类激动剂的 cAMP 积累和 β-arrestin 招募实验[1]
a-b: Opium类激动剂的 cAMP 积累 (a) 和 β-arrestin2 (b) 招募的剂量依赖反应曲线。DAMGO 为对照物，数据根据 DAMGO 的最大反应进行归一化。
■ 激活 μOR 的关键因素是什么？
Fentanyl和Morphine的化学骨架彼此不同，因此，作者分别研究了它们与 μOR 的特异性结合方式。研究表明，Fentanyl分子在正位口袋中占据 "Y" 形构象，主要与跨膜结构域 (TMD) 的 TM2、TM3、TM6 和 TM7 的残基接触；Morphine采用椭圆的 "O" 型结构，与来自 TM3、TM6 和 TM7 的疏水残基相互作用 (图 3)。该研究发现，D1493.32 与附近的残基 Q1262.60 和 Y3287.43（DQY 极性模体，以下简称 DQY模体）在两个结构中形成极性相互作用 (图 3a-b)，并且 DQY 极性模体的突变，在很大程度上降低了Fentanyl和Morphine的 G 蛋白和 β-arrestin 信号转导的效力，这表明 DQY 极性模体对 μOR 的激活至关重要。
图 3. Fentanyl (a) 和Morphine (b) 与 μOR 的相互作用[1]
此外，Fentanyl和Morphine配体结合袋周围的残基突变，包括 Y1503.33、M1533.36、V2385.42、I2986.51 和 H2996.52，导致两种配体对 G 蛋白和 β-arrestin 信号的活性减弱 (图 4a-b)。
图 4. a: Fentanyl和Morphine对 μOR 突变体的 Gi 激活减少所诱导的 cAMP 积累。每一栏的数值表示代表性的 μOR 突变体相对于 WT μOR的效力 (ΔpEC50) 的差异。b: Fentanyl (上) 和Morphine (下) 激活的小袋中 WT 和突变体 μORs 的 cAMP 测定[1]
■ 引起 β-arrestin 信号转导的关键因素又是什么？
作者对 μOR 正位结合口袋的残基进行了突变，并测试了这些突变体分别通过Fentanyl、Morphine和 DAMGO 激活 G 蛋白信号和 β-arrestin 招募的能力。
结果显示，与 TM2 和 TM3 侧的残基相比，TM6 和 TM7 附近的残基突变对 β-arrestin 信号的影响更为明显。比如，来自 TM6 的 W295A 和来自 TM7 的W320A 突变在 cAMP 积累和 G 蛋白招募方面对 G 蛋白信号转导只有最小或部分影响，而它们几乎取消了Fentanyl、Morphine和 DAMGO 诱导的 β-arrestin 招募 (图 5b)。
这说明，配体与 TM6/7 的相互作用对引起 β-arrestin 的信号转导至关重要。
图 5. TM6/7 的代表性残基的突变适度影响了 cAMP 反应，但取消了Fentanyl (a)、morphine (b) 和DAMGO (c) 诱导的 β-arrestin 2 的招募[1]
■ 设计分子降低 β-arrestin 活性了吗？为了进一步验证上述发现，作者设计了两个结构相似的Fentanyl衍生物 FBD1 (部分激动剂) 和 FBD3 (完全激动剂)，以获得 β-arrestin 信号传导减少/消失但 G 蛋白活性相对完整的 μOR 激动剂 (图 6a)，也就是说，FBD1 和 FBD3 与μOR 的 TM6/7 之间的相互作用被削弱。
实验结果显示：与Fentanyl相比，FBD1 和 FBD3 都显示出 β-arrestin 招募活性的极大降低，并且，FBD3 在 cAMP 抑制或 Gi 招募试验中显示出与Fentanyl几乎相同的效力和效率 (图 6b-c)。
图 6. (a) Fentanyl衍生物 FBD1 和 FBD3 的合成。(b-c) 以Fentanyl为对照物 (b) FBD1 和 FBD3 的cAMP 积累试验和 Gi 招募 (c) 的剂量反应曲线图[1]
该研究进一步说明了配体与 TM6/7 的相互作用对引起 μOR 的 β-arrestin 信号转导至关重要，减少这种相互作用可能导致配体优先通过 G 蛋白途径转导信号 (图 7)。
图 7. μOR 的配体诱导的不同信号模型[1]
这篇文章揭示了人类 μ 型Opium受体对morphine和Fentanyl的分子识别方式，并提出了基于Fentanyl结构的类似物设计，削弱 μOR 的 β-arrestin 活性的思路。该研究有助于合理设计下一代镇痛剂，并有望在减少Opioids副作用的同时不影响其镇痛作用，甚至增强镇痛效果。
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SR17018 μ 型Opium受体激动剂，能与 GTPγS 结合 (EC50 = 97 nM)。 |
参考文献
[1] Zhuang Y, H. Eric Xu, Xin Xie, Ming-Wei Wan, et al. Molecular recognition of morphine and fentanyl by the human μ-opioid receptor. Cell. 2022 Nov 10;185(23):4361-4375.e19.
[2] Vadivelu N, et al. The Opioid Crisis: a Comprehensive Overview. Curr Pain Headache Rep. 2018 Feb 23;22(3):16.
