利用微流体分液技术实现细胞活性测定的自动化
摘要
我们使用细胞活性测定来研究生物活性分子的效力或毒性。而发光 CellTiter-Glo® (CTG) 检测一种广泛用于测量细胞活性的技术。 它是一种基于 ATP 定量的均相方法，ATP 是代谢活跃细胞的指标。然而，在需要延长培养时间的多个时间点的细胞活性研究中，CTG 往往会变干并形成堵塞物。在本研究中，我们检查和比较了使用两种试剂分配器 - Multidrop® Combi (ThermoFisher) 和 TEMPEST® (FORMULATRIX®) - 进行的长时间培养 CTG 检测的结果。
介绍
CellTiter-Glo 是一种常用的细胞活性检测方法，可将 ATP 水平量化为代谢活动的指标。测定的同质“添加-混合-检测”形式使其非常适合自动化。但是，重构的 CellTiter-Glo 试剂是一种浓缩的预混液，如果干燥，很容易堵塞分液器。这对延长细胞培养时间的自动化测定提出了挑战，因为在培养期间分液器保持待机状态，很容易堵塞并需要人工处理解决。
Multidrop® Combi 是一款广泛使用的快速八通道蠕动分液器，在分配 2 μL 液体时一般具有的 ±10% 的不准确度和不精确度。
TEMPEST（图 1）是一款非接触式液体分配器，可配置多达 12 个微型隔膜芯片，这些芯片分液由多达 96 个独立控制的喷嘴共同完成。 TEMPEST 芯片与多种试剂兼容，粘度高达 25 cP（70% 甘油，20 C），能够以高精度和高精度分配小体积溶液（表 1）。
图1. TEMPEST
芯片的设计实现了试剂的双向运动：a) 从储液器通过喷嘴分配 b) 在喷嘴关闭的情况下在储液器和芯片之间进行再循环。即使在仪器没有分液的情况下，TEMPEST 的再循环功能也能保证芯片内的液体移动，使滞留体积中的悬浮液保持均匀并防止其堵塞管道（图 2）。
表 1. TEMPEST 芯片的分液体积相关参数。
图 2. 分液和再循环过程中 TEMPEST 芯片流体路径示意图
材料和方法
通过 TEMPEST 或 Multidrop Combi，我们将 SNU-1 细胞接种在 1536 孔板（Corning #3893）中的 5 μL 培养基中。将板在 37°C、98% 相对湿度和 5% CO2 条件下培养长达 72 小时。 对于 CTG 测定 (Promega)，我们在每孔中加入 1 μL 的 CTG，使用与细胞接种相同的仪器。 我们研究了两个时间点：1) 时间 = 0（将细胞添加到微孔板后一小时内）和 2) 时间 = 72 小时。 在时间 = 0 时，我们使用新鲜的 CTG。在时间 = 72 小时时，我们进行了两个实验：1) 使用新鲜的 CTG，和 2) 使用留在已充注仪器上过夜（16 小时）的 CTG。 我们使用 Envision (PerkinElmer) 对微孔板成像，并用 ActivityBase (IDBS) 分析细胞代谢活性。
结果和讨论
根据我们的经验，Multidrop Combi 能够在日常操作中始终如一地提供准确和精确的分液，其中能对大量微孔板进行快速连续分液。我们以使用新鲜 CTG 的时间 = 0 点为例说明了该观察结果（图 2，左）。另一方面，使用 TEMPEST 进行的检测表现出略低的离散度，其中高于零抑制的孔较少（图 2，右）。这可能是由于微隔膜分液技术比蠕动技术京都更高。
在时间 = 72 小时使用新鲜 CTG 进行的细胞活性测定中，使用 Multidrop Combi 的效果还是和预期一样。 Multidrop Combi（图 3，左）和 TEMPEST（图 3，左）的信号背景比 (S/B) 相当，分别计算为 345 和 408。 相似的 S/B 比率表明平板上的细胞处于相同的代谢活动水平，表明这两种仪器对长期细胞活性具有相同影响或是没有影响。然而，两种仪器之间的数据离散度差异甚至比时间 = 0 时更大，TEMPEST 的 Z' = 0.7，而 Multidrop Combi 的 Z' = 0.56，这正好解释了使用 TEMPEST 进行分析时信号背景比和前者相比高约 18% 。
当 CTG 保留在仪器上过夜时，情况发生了巨大变化。 Multidrop Combi 管道堵塞，无法获得数据，而 TEMPEST 的再循环功能则完全避免了这一情况。此外，使用 TEMPEST 处理新鲜 CTG 的产生的数据（图 3，左）与使用过夜 CTG （图 3，右）获得的数据几乎没有区别。这种一致性令人惊讶，因为根据制造商的说法，重构的 CTG 试剂可以在室温下储存长达八小时，以将活性损失保持在 10% 以下。一种可能的解释是通过再循环频繁混合可延长 CTG 试剂的半衰期。
结论
我们通过 TEMPEST 或 Multidrop Combi 分液器实施 CellTiter-Glo 测定法对细胞活性进行研究。两种仪器之间的数据具有可比性，但是使用 TEMPEST 进行分液的试验从时间 = 0 开始始终具有较低的离散度。时间 = 72 小时使用 TEMPEST 分配新鲜 CTG 的试验有着更高的 Z` 和高约 18% 信号背景比。 当 CTG 在仪器上放置过夜时，它会堵塞 Multidrop Combi 管道，因此无法获得数据。然而，TEMPEST 的再循环功能可防止 CTG 在一夜之间变干并堵塞芯片，生成的数据几乎与使用新鲜 CTG 获得的数据相同。
总体而言，具有再循环功能的 TEMPEST 非常适合高通量全自动 CTG 分析，无需在机器待机期间进行人为处理。这些观察结果表明，Tempest 的使用可以更广泛地扩展到涉及分配沉淀悬浮液、需要稳定的非环境温度的试剂以及干燥时会堵塞的高浓度溶液的工作流程。该研究还表明，TEMPEST 的分液足够温和，可用于分配细胞悬液。
致谢
这项研究是与 Forma Therapeutics 合作进行的。 Forma 现在是 Novo Nordisk 的一部分，是一家临床阶段的生物制药公司，专注于新疗法的开发和商业化，以改变罕见血液病和癌症患者的生活。他们药物研发的专业知识创造了一系列小分子候选产品，专注于未满足患者需求的适应症。
我们使用细胞活性测定来研究生物活性分子的效力或毒性。而发光 CellTiter-Glo® (CTG) 检测一种广泛用于测量细胞活性的技术。 它是一种基于 ATP 定量的均相方法，ATP 是代谢活跃细胞的指标。然而，在需要延长培养时间的多个时间点的细胞活性研究中，CTG 往往会变干并形成堵塞物。在本研究中，我们检查和比较了使用两种试剂分配器 - Multidrop® Combi (ThermoFisher) 和 TEMPEST® (FORMULATRIX®) - 进行的长时间培养 CTG 检测的结果。
介绍
CellTiter-Glo 是一种常用的细胞活性检测方法，可将 ATP 水平量化为代谢活动的指标。测定的同质“添加-混合-检测”形式使其非常适合自动化。但是，重构的 CellTiter-Glo 试剂是一种浓缩的预混液，如果干燥，很容易堵塞分液器。这对延长细胞培养时间的自动化测定提出了挑战，因为在培养期间分液器保持待机状态，很容易堵塞并需要人工处理解决。
Multidrop® Combi 是一款广泛使用的快速八通道蠕动分液器，在分配 2 μL 液体时一般具有的 ±10% 的不准确度和不精确度。
TEMPEST（图 1）是一款非接触式液体分配器，可配置多达 12 个微型隔膜芯片，这些芯片分液由多达 96 个独立控制的喷嘴共同完成。 TEMPEST 芯片与多种试剂兼容，粘度高达 25 cP（70% 甘油，20 C），能够以高精度和高精度分配小体积溶液（表 1）。
图1. TEMPEST
芯片的设计实现了试剂的双向运动：a) 从储液器通过喷嘴分配 b) 在喷嘴关闭的情况下在储液器和芯片之间进行再循环。即使在仪器没有分液的情况下，TEMPEST 的再循环功能也能保证芯片内的液体移动，使滞留体积中的悬浮液保持均匀并防止其堵塞管道（图 2）。
表 1. TEMPEST 芯片的分液体积相关参数。
图 2. 分液和再循环过程中 TEMPEST 芯片流体路径示意图
材料和方法
通过 TEMPEST 或 Multidrop Combi，我们将 SNU-1 细胞接种在 1536 孔板（Corning #3893）中的 5 μL 培养基中。将板在 37°C、98% 相对湿度和 5% CO2 条件下培养长达 72 小时。 对于 CTG 测定 (Promega)，我们在每孔中加入 1 μL 的 CTG，使用与细胞接种相同的仪器。 我们研究了两个时间点：1) 时间 = 0（将细胞添加到微孔板后一小时内）和 2) 时间 = 72 小时。 在时间 = 0 时，我们使用新鲜的 CTG。在时间 = 72 小时时，我们进行了两个实验：1) 使用新鲜的 CTG，和 2) 使用留在已充注仪器上过夜（16 小时）的 CTG。 我们使用 Envision (PerkinElmer) 对微孔板成像，并用 ActivityBase (IDBS) 分析细胞代谢活性。
结果和讨论
根据我们的经验，Multidrop Combi 能够在日常操作中始终如一地提供准确和精确的分液，其中能对大量微孔板进行快速连续分液。我们以使用新鲜 CTG 的时间 = 0 点为例说明了该观察结果（图 2，左）。另一方面，使用 TEMPEST 进行的检测表现出略低的离散度，其中高于零抑制的孔较少（图 2，右）。这可能是由于微隔膜分液技术比蠕动技术京都更高。
图 2. 时间=0 时的细胞活性。左边使用的是 Multidrop Combi，右边使用的是 TEMPEST
在时间 = 72 小时使用新鲜 CTG 进行的细胞活性测定中，使用 Multidrop Combi 的效果还是和预期一样。 Multidrop Combi（图 3，左）和 TEMPEST（图 3，左）的信号背景比 (S/B) 相当，分别计算为 345 和 408。 相似的 S/B 比率表明平板上的细胞处于相同的代谢活动水平，表明这两种仪器对长期细胞活性具有相同影响或是没有影响。然而，两种仪器之间的数据离散度差异甚至比时间 = 0 时更大，TEMPEST 的 Z' = 0.7，而 Multidrop Combi 的 Z' = 0.56，这正好解释了使用 TEMPEST 进行分析时信号背景比和前者相比高约 18% 。
图 3. 使用新鲜 CTG 在时间 = 72 小时的细胞存活率。
左侧使用的是 Multidrop® Combi，右侧使用的是 TEMPEST®
当 CTG 保留在仪器上过夜时，情况发生了巨大变化。 Multidrop Combi 管道堵塞，无法获得数据，而 TEMPEST 的再循环功能则完全避免了这一情况。此外，使用 TEMPEST 处理新鲜 CTG 的产生的数据（图 3，左）与使用过夜 CTG （图 3，右）获得的数据几乎没有区别。这种一致性令人惊讶，因为根据制造商的说法，重构的 CTG 试剂可以在室温下储存长达八小时，以将活性损失保持在 10% 以下。一种可能的解释是通过再循环频繁混合可延长 CTG 试剂的半衰期。
图 4. 时间 = 72 小时的细胞活性。
左侧使用 TEMPEST 分配新鲜的 CTG，右侧使用 TEMPEST 分配 16 小时的 CTG。
结论
我们通过 TEMPEST 或 Multidrop Combi 分液器实施 CellTiter-Glo 测定法对细胞活性进行研究。两种仪器之间的数据具有可比性，但是使用 TEMPEST 进行分液的试验从时间 = 0 开始始终具有较低的离散度。时间 = 72 小时使用 TEMPEST 分配新鲜 CTG 的试验有着更高的 Z` 和高约 18% 信号背景比。 当 CTG 在仪器上放置过夜时，它会堵塞 Multidrop Combi 管道，因此无法获得数据。然而，TEMPEST 的再循环功能可防止 CTG 在一夜之间变干并堵塞芯片，生成的数据几乎与使用新鲜 CTG 获得的数据相同。
总体而言，具有再循环功能的 TEMPEST 非常适合高通量全自动 CTG 分析，无需在机器待机期间进行人为处理。这些观察结果表明，Tempest 的使用可以更广泛地扩展到涉及分配沉淀悬浮液、需要稳定的非环境温度的试剂以及干燥时会堵塞的高浓度溶液的工作流程。该研究还表明，TEMPEST 的分液足够温和，可用于分配细胞悬液。
致谢
这项研究是与 Forma Therapeutics 合作进行的。 Forma 现在是 Novo Nordisk 的一部分，是一家临床阶段的生物制药公司，专注于新疗法的开发和商业化，以改变罕见血液病和癌症患者的生活。他们药物研发的专业知识创造了一系列小分子候选产品，专注于未满足患者需求的适应症。
