支原体检测试剂盒说明书(QPCR法）
【产品规格】
BPM50 50 次/盒
【产品说明】
支原体(mycoplasma)：目前发现的最小的原核生物，据统计约 15~35% 的细胞被支原体污染。支原体污染会改变宿主细胞的结构与功能，易致实验结果不稳定，须对培养细胞定期进行支原体检测。
本产品试剂盒采用双色荧光 qPCR (TaqMan 探针法)检测支原体DNA，检测对象为细胞培养的上清液或细胞本身。该试剂盒具有以下特点：
灵敏：配合高效 DNA 提取试剂盒，检测灵敏度达 10cfu/mL。
稳定：全程闭管操作，无交叉污染。
可靠：含内参基因，避免假阴性。
方便：操作简单，无需电泳步骤。
定量：以 CT 值判断，可定量检测。
【运输及保存条件】
低温冷冻运输， -20℃保存，有效期 1 年。
【产品组分】
组分名称 BPM50
Mycoplasma Probe qPCR SuperMix 900µL
Mycoplasma Probe qPCR SuperMix 900µL
Mycoplasma Positive Control 100µL
RNase Free Water 100µL
注：Positive Control 浓度为 2×10 3拷贝/µL。本试剂盒提供试剂，使用前先低速离心后小心开启。使用时请上下轻柔颠倒十次混匀，避免起泡，并低速短暂离心后使用。
【操作步骤】
1. 样本制备（自备）
A 样本的标准制备方案：请使用高效DNA 提取试剂盒取样本 DNA。推荐使用无微生物污染级别的核酸提取试剂盒。低温保存的血清、脐带血、胰酶、抗生素、未使用的培养液等生物制品，即使存在支原体污染，一般支原体含量也较少，建议提取样本DNA 后检测。
B 样本的简易快速制备方案：可用于细胞培养上清、细胞悬液、血液，样本制备步骤如下。
（1） 细胞培养上清：取 1~1.5mL 细胞培养上清；
（2） 细胞悬液：直接取 2µL 细胞悬液作为模板进行qPCR 反应。要求样本内细胞总数量不超过 10000 个，样本可用细胞培养基稀释400 rpm 离心 3 分钟；取 2µL 上清作为模板进行qPCR反应。
（3） 血液：直接取血液样本作为模板进行 qPCR 反应。注意血液中的细胞对PCR反应有较强抑制作用，内参检测通道会显示异常。根据不同应用场景，有两个建议：①中间质控环节，对灵敏度要求中等，无需达到10cfu/mL，可用无菌水稀释 10 倍，充分混匀后，取 2µL作为模板进行 qPCR 反应。②放行检测，要求灵敏度达到10cfu/mL，建议提取样本DNA 后检测。
2. qPCR 反应体系及条件
反应体系以20µL为例：
PCR 仪设置以 ABI 7500 为例，相对定量模式，选择
TaqMan 探针法：
【阈值设置】
以ABI 7500 为例，扩增曲线选择 log 法，基线设置3~15 个循环。建议用 log 法扩增曲线保证结果稳定可靠。
（1）内参(HEX/VIC)阈值设定：以阴性对照定内参扩增曲线阈值，将内参的CT 值定为 27±2。
（2）支原体(FAM)阈值设定：以阳性对照定支原体扩增曲线阈值，将支原体(FAM)的CT值定为 26±3。
说明：
如果阳性对照管的支原体(FAM)CT 值>30，但阳性对照管及阴性对照管的内参(HEX)CT 值正常，表明阳性支原体对照模板有降解。
如果阴性对照管的内参(HEX/VIC)CT值>30，阳性对照管的内参(HEX)CT值>30 且支原体(FAM)CT值>30，表明 Mycoplasma Probe qPCR SuperMix 试剂成分已失效。
【结果判读】
根据支原体(FAM) CT 值判定是否发生支原体污染，具体标准如下：
注：检测结果落在灰区或与其他方法检测结果矛盾时：
1. 检查内参通道扩增是否正常，扩增曲线是否选择log 法。
2. 内参扩增不正常，表明 PCR 反应未正常进行，PCR 体系受到干扰，需重复检测
3. 内参扩增正常，结合 CT值和扩增曲线形态判断。
4. 无典型扩增曲线，可认为该样本为支原体阴性。
5. 有典型扩增曲线，需重复检测。重复结果不一致判为阴性；结果一致，判为弱阳性。
【注意事项】
由于 PCR 反应非常灵敏，实验操作中应注意以下事项，以免发生DNA 污染：
1. 建议阳性对照与待测样本、阴性对照在实验室的不同区域进行添加，在 qPCR 反应板上阳性对照的排布应远离待测样本和阴性对照。
2. 建议使用不同的移液器添加阳性对照与待测样本、阴性对照，并使用带滤芯的枪头进行加样。
3. 试剂盒开启后，阳性对照应与试剂 Mix、阴性对照分开存放。
4. qPCR 封膜时须反复压紧。
5. 实验室环境须定期清除支原体
