METTL3介导的m6A甲基化谱调控肌肉干细胞成肌细胞状态转换
2020年9月29日，《Cell Death Discovery》（IF: 7.109）杂志发表了题为“A defined N6-methyladenosine (m6A) profile conferred by METTL3 regulates muscle stem cell/myoblast state transitions”的研究论文，研究通过MeRIP-seq（m6A-seq）等实验鉴定了通过Mettl3在mRNA上的m6A沉积是否是体外和体内肌肉特异性成体干细胞（MuSC）/成肌细胞状态的调控因子。
标题：A defined N6-methyladenosine (m6A) profile conferred by METTL3 regulates muscle stem cell/myoblast state transitions（METTL3介导的m6A甲基化谱调控肌肉干细胞成肌细胞状态转换）
时间：2020.9.29
期刊：Cell Death Discovery
影响因子：IF 7.109
技术平台：MeRIP-seq、RNA-seq、m6A液相色谱/质谱（LC-MS）、RT-PCR等
项目设计
（1）样本选取：
Cg-Pax7 tm1（Cre / ERT2）Gaka / J小鼠（JAX：017763）与B6N.129S6-Gt（ROSA）26Sor tm1（CAG-tdTomato *，-EGFP）/ Ees / J小鼠杂交（ JAX：005304）产生小树：Pax7 CreERT2；Rosa26 nTnG（以下称为Pax7 nTnG）。Pax7 nTnG小鼠用于所有肌肉损伤实验。普遍表达荧光素酶的小鼠FVB-TG（CAG-luc, -GFP）L2G85Chco / J（JAX：008450, CMV-luc小鼠）被用于分离供体细胞进行移植实验并被移植到免疫缺陷的NSG小鼠中（NOD. Cg-Prkdc scid Il2rg tm1Wjl / SzJ，JAX：005557）。
（2）项目设计流程图：
研究目的
肌肉特异性成体干细胞(MuSCs)为骨骼肌再生所必需。为确保损伤后骨骼肌的有效再生，MuSCs必须经历从静止状态被激活的状态转换，从而产生大量增殖的成肌细胞，并继续进行终末分化，修复或替换受损的肌纤维，或者自我更新以重新填充静止的细胞群。MUSC/成肌细胞状态的变化伴随着其转录谱的显著动态变化。此前研究已报道鉴定了成体干细胞系统中由m6A writers METTL3介导最丰富的内部mRNA修饰N6-甲基腺苷(m6A)发生了变化，并通过改变这些细胞的转录谱来调控细胞状态转换。本研究目的是确定通过METTL3的m6A修饰沉积是否在体外和体内对MUSC/成肌细胞状态转换起调节作用。研究使用液相色谱/质谱（LC-MS）分析表明在体内骨骼肌再生的早期阶段，整体m6A水平增加；在体外C2C12成肌细胞从增殖状态转变为分化状态时，整体m6A水平下降。使用m6A特异性RNA测序（MeRIP-seq）鉴定了m6A修饰的不同图谱，区分了增殖状态和分化状态的C2C12成肌细胞。RNAi研究表明，降低m6A甲基转移酶METTL3的活性水平可以降低整体m6A水平，并促进C2C12成肌细胞过早分化。在移植前降低原代小鼠MuSC中的METTL3水平可以增强了其在原代移植时的植入能力，但其连续移植能力缺失。总之，本研究证明了METTL3可以调控MuSCs/成肌细胞中的m6A水平，并调控MuSCs/成肌细胞向不同细胞状态的转变。此外本研究为增殖和分化C2C12成肌细胞中的m6A修饰提供了第一个转录组图谱，并揭示了可能调控MuSC/成肌细胞状态转换的新的基因。
实验结果
（1）在MuSC从增殖到分化过程中，整体m6A水平下降
图1：m6A修饰在再生骨骼肌和C2C12成肌细胞中受动态调控
（2）MeRIP-seq揭示了转录本特异性m6A修饰丰度的动态变化，但未揭示转录本上m6A修饰位点的频率变化
为了绘制由m6A标记的转录组在成肌细胞从增殖转换到分化时的动态变化，研究在GM和3d DM样品中进行了MeRIP-seq。MeRIP-seq证实了LC–MS数据，并揭示了在GM（相对于3d DM）样品中m6A修饰的转录本富集。在GM和3d DM样本中，m6A在转录本上的分布相似，最富集在编码序列和3′区域的边界区域。因此可以得出结论，m6A富集的整体和转录本特异性程序与维持成肌细胞在增殖状态有关，并且这种作用并非受转录本上m6A修饰位点差异驱动。
（3）单个转录本水平上的增殖特异性m6A谱的表征
MeRIP-seq分析显示1607 个m6A peaks代表862个富含GM的特异性基因；通过倍数变化> 1.0（GM / 3d DM）确定RNA-seq数据集中转录本表达的增加。MeRIP-seq和RNA-seq数据集之间受影响的分子功能通路的不完全重叠分析表明，GM期间m6A修饰的某些功能结果超出了增强的转录本稳定性和/或衰减。
图2：MeRIP-seq分析将转录调控鉴定为C2C12成肌细胞增殖过程中m6A修饰的主要靶点
（4）个体转录水平上分化特异性m6A谱的表征
3d DM MeRIP-seq数据集中富集了m6A的转录本进行了重复分析，鉴定出573 个m6A peaks与340个特异性基因相关，这些基因在3d DM与GM样品中显著富集。PANTHER GO-slim分子功能通路分析显示，与转录调控相关的分子功能通路比GM数据集中的更少。3d DM富集的最主要通路是微管结合（icrotubule binding）。与GM不同的是，MeRIP-seq数据集中鉴定的所有分子功能通路都包含RNA-seq数据集，这表明与GM相比，3d DM中与m6A修饰和转录丰度相关性更强。
图3：MeRIP-seq分析将微管结合鉴定为C2C12成肌细胞分化过程中m6A修饰的主要靶标
（5） Mettl3调控成肌细胞从增殖到分化的过渡
假设由于活性m6A writers Mettl3表达增加，m6A水平在GM样品中富集。为了模拟再生过程中的MuSC活性，培养C2C12成肌细胞和原代小鼠成肌细胞，然后通过血清限制促使其在体外分化；分化开始后，C2C12成肌细胞（图4a）和原代小鼠成肌细胞（图4b）中的Mettl3表达水平显著下降。
为确定单独m6A修饰沉积是否足以启动分化，用靶向Mettl3的siRNA处理C2C12成肌细胞，其成功地降低m6A修饰，而Mettl3敲低会减少细胞计数。还评估了Mettl3敲低对与增殖（Pax7）、早期分化（Myod1）和晚期分化（Myog）相关的MRF影响。Mettl3敲低后Myod1和Myog的基因表达显著增加，且显著增加表达eMHC的C2C12成肌细胞数量（eMHC是终末分化标志物），这些数据支持一种模型，在该模型中，增殖的C2C12成肌细胞中的Mettl3敲低可降低m6A修饰的整体水平并导致成肌细胞的过早分化。
图4：Mettl3敲低促进成肌细胞过早分化
（6）Mettl3基因敲低影响原发性MuSC植入
当在移植前将Mettl3敲低时，移植的MuSC植入和生物发光表达的可能性得到改善。
图5：Mettl3敲低增强了初次移植后的MuSC植入
参考文献：
Gheller BJ, Blum JE, Fong EHH, Malysheva OV, Cosgrove BD, Thalacker-Mercer AE. A defined N6-methyladenosine (m6A) profile conferred by METTL3 regulates muscle stem cell/myoblast state transitions. Cell Death Discov. 2020;6(1):95.
标题：A defined N6-methyladenosine (m6A) profile conferred by METTL3 regulates muscle stem cell/myoblast state transitions（METTL3介导的m6A甲基化谱调控肌肉干细胞成肌细胞状态转换）时间：2020.9.29
期刊：Cell Death Discovery
影响因子：IF 7.109
技术平台：MeRIP-seq、RNA-seq、m6A液相色谱/质谱（LC-MS）、RT-PCR等
项目设计
（1）样本选取：
Cg-Pax7 tm1（Cre / ERT2）Gaka / J小鼠（JAX：017763）与B6N.129S6-Gt（ROSA）26Sor tm1（CAG-tdTomato *，-EGFP）/ Ees / J小鼠杂交（ JAX：005304）产生小树：Pax7 CreERT2；Rosa26 nTnG（以下称为Pax7 nTnG）。Pax7 nTnG小鼠用于所有肌肉损伤实验。普遍表达荧光素酶的小鼠FVB-TG（CAG-luc, -GFP）L2G85Chco / J（JAX：008450, CMV-luc小鼠）被用于分离供体细胞进行移植实验并被移植到免疫缺陷的NSG小鼠中（NOD. Cg-Prkdc scid Il2rg tm1Wjl / SzJ，JAX：005557）。
（2）项目设计流程图：
研究目的肌肉特异性成体干细胞(MuSCs)为骨骼肌再生所必需。为确保损伤后骨骼肌的有效再生，MuSCs必须经历从静止状态被激活的状态转换，从而产生大量增殖的成肌细胞，并继续进行终末分化，修复或替换受损的肌纤维，或者自我更新以重新填充静止的细胞群。MUSC/成肌细胞状态的变化伴随着其转录谱的显著动态变化。此前研究已报道鉴定了成体干细胞系统中由m6A writers METTL3介导最丰富的内部mRNA修饰N6-甲基腺苷(m6A)发生了变化，并通过改变这些细胞的转录谱来调控细胞状态转换。本研究目的是确定通过METTL3的m6A修饰沉积是否在体外和体内对MUSC/成肌细胞状态转换起调节作用。研究使用液相色谱/质谱（LC-MS）分析表明在体内骨骼肌再生的早期阶段，整体m6A水平增加；在体外C2C12成肌细胞从增殖状态转变为分化状态时，整体m6A水平下降。使用m6A特异性RNA测序（MeRIP-seq）鉴定了m6A修饰的不同图谱，区分了增殖状态和分化状态的C2C12成肌细胞。RNAi研究表明，降低m6A甲基转移酶METTL3的活性水平可以降低整体m6A水平，并促进C2C12成肌细胞过早分化。在移植前降低原代小鼠MuSC中的METTL3水平可以增强了其在原代移植时的植入能力，但其连续移植能力缺失。总之，本研究证明了METTL3可以调控MuSCs/成肌细胞中的m6A水平，并调控MuSCs/成肌细胞向不同细胞状态的转变。此外本研究为增殖和分化C2C12成肌细胞中的m6A修饰提供了第一个转录组图谱，并揭示了可能调控MuSC/成肌细胞状态转换的新的基因。
实验结果
（1）在MuSC从增殖到分化过程中，整体m6A水平下降
图1：m6A修饰在再生骨骼肌和C2C12成肌细胞中受动态调控（2）MeRIP-seq揭示了转录本特异性m6A修饰丰度的动态变化，但未揭示转录本上m6A修饰位点的频率变化
为了绘制由m6A标记的转录组在成肌细胞从增殖转换到分化时的动态变化，研究在GM和3d DM样品中进行了MeRIP-seq。MeRIP-seq证实了LC–MS数据，并揭示了在GM（相对于3d DM）样品中m6A修饰的转录本富集。在GM和3d DM样本中，m6A在转录本上的分布相似，最富集在编码序列和3′区域的边界区域。因此可以得出结论，m6A富集的整体和转录本特异性程序与维持成肌细胞在增殖状态有关，并且这种作用并非受转录本上m6A修饰位点差异驱动。
（3）单个转录本水平上的增殖特异性m6A谱的表征
MeRIP-seq分析显示1607 个m6A peaks代表862个富含GM的特异性基因；通过倍数变化> 1.0（GM / 3d DM）确定RNA-seq数据集中转录本表达的增加。MeRIP-seq和RNA-seq数据集之间受影响的分子功能通路的不完全重叠分析表明，GM期间m6A修饰的某些功能结果超出了增强的转录本稳定性和/或衰减。
图2：MeRIP-seq分析将转录调控鉴定为C2C12成肌细胞增殖过程中m6A修饰的主要靶点（4）个体转录水平上分化特异性m6A谱的表征
3d DM MeRIP-seq数据集中富集了m6A的转录本进行了重复分析，鉴定出573 个m6A peaks与340个特异性基因相关，这些基因在3d DM与GM样品中显著富集。PANTHER GO-slim分子功能通路分析显示，与转录调控相关的分子功能通路比GM数据集中的更少。3d DM富集的最主要通路是微管结合（icrotubule binding）。与GM不同的是，MeRIP-seq数据集中鉴定的所有分子功能通路都包含RNA-seq数据集，这表明与GM相比，3d DM中与m6A修饰和转录丰度相关性更强。
图3：MeRIP-seq分析将微管结合鉴定为C2C12成肌细胞分化过程中m6A修饰的主要靶标（5） Mettl3调控成肌细胞从增殖到分化的过渡
假设由于活性m6A writers Mettl3表达增加，m6A水平在GM样品中富集。为了模拟再生过程中的MuSC活性，培养C2C12成肌细胞和原代小鼠成肌细胞，然后通过血清限制促使其在体外分化；分化开始后，C2C12成肌细胞（图4a）和原代小鼠成肌细胞（图4b）中的Mettl3表达水平显著下降。
为确定单独m6A修饰沉积是否足以启动分化，用靶向Mettl3的siRNA处理C2C12成肌细胞，其成功地降低m6A修饰，而Mettl3敲低会减少细胞计数。还评估了Mettl3敲低对与增殖（Pax7）、早期分化（Myod1）和晚期分化（Myog）相关的MRF影响。Mettl3敲低后Myod1和Myog的基因表达显著增加，且显著增加表达eMHC的C2C12成肌细胞数量（eMHC是终末分化标志物），这些数据支持一种模型，在该模型中，增殖的C2C12成肌细胞中的Mettl3敲低可降低m6A修饰的整体水平并导致成肌细胞的过早分化。
图4：Mettl3敲低促进成肌细胞过早分化（6）Mettl3基因敲低影响原发性MuSC植入
当在移植前将Mettl3敲低时，移植的MuSC植入和生物发光表达的可能性得到改善。
图5：Mettl3敲低增强了初次移植后的MuSC植入参考文献：
Gheller BJ, Blum JE, Fong EHH, Malysheva OV, Cosgrove BD, Thalacker-Mercer AE. A defined N6-methyladenosine (m6A) profile conferred by METTL3 regulates muscle stem cell/myoblast state transitions. Cell Death Discov. 2020;6(1):95.
