体外血管生成三维培养模型构建应用指南

以下实验数据与结果皆来源于TheWell实验室。

我们使用即用型VitroGel Angiogenesis Assay Kit和高浓度VitroGel Angiogenesis Assay HC Kit来证明水凝胶特性修饰对人脐静脉内皮细胞（HUVEC）血管生成检测的影响。

实验从2D水凝胶包被培养方法开始，其中我们在细胞培养板底部从VitroGel AAK制备了一层厚厚的水凝胶，并将HUVEC细胞接种在水凝胶层的顶部。HUVEC血管生成对不同的水凝胶组成（血管内皮生长因子（VEGF）阳性，VEGF阴性或无生长因子）表现出显著差异，即使使用相同的内皮细胞完全培养基，也显示不同的管腔结构和血管形成。另一方面，我们能够通过使用VitroGel AAK-HC来调节水凝胶浓度。数据表明，除了基质内的生长因子外，机械性能还会严重影响细胞活力和管形成 - 由于依赖于天然ECM的传统实验的限制，这种影响以前是未知的。当HUVEC被包裹在水凝胶中时，同样的观察结果可以进一步扩展到3D细胞培养。

结果显示水凝胶的可调节性和机械强度以及使用VitroGel水凝胶的最佳浓度，培养时间和3D血管结构形成的影响。我们证明生长因子不仅存在于培养基中，而且存在于水凝胶本身中，显著影响管的形成。用无异源可调节的VitroGel水凝胶系统代替天然ECM，研究人员能够研究微环境的物理、化学、生物学特性与细胞行为之间的关系。

简而言之，两种体外水凝胶血管生成试剂盒是研究人员探索血管生成的强大工具。我们希望这些试剂盒能助力研究人员和研究团队建立复杂的组织模型，以提升药物筛选过程、细胞侵袭测定以及内皮细胞和血管生成的疾病相关研究。

材料和方法

一、细胞培养

将人脐静脉内皮细胞（HUVEC）维持在含有10%胎牛血清（FBS）和1x青霉素-链霉素抗生素的内皮细胞完全培养基（EGM）中。当细胞达到80-90%融合率时进行细胞传代。
 

二、调节水凝胶性能

✦ 01、研究水凝胶中生长因子对血管生成的影响
为了研究水凝胶内生长因子对细胞生长和血管生成的影响，将HUVEC与即用型VitroGel AAK试剂盒一起使用。两种类型的VitroGel AAK添加物可用于直接与VitroGel AAK混合。VitroGel AAK Supplement 1（不含VEGF）用于制备VEGF阴性水凝胶，VitroGel AAK Supplement 2（含VEGF）用于制备VEGF阳性水凝胶。为了制备不含额外生长因子的水凝胶，我们使用VitroGel AAK水凝胶直接与EGM基础培养基混合（请阅读VitroGel AAK试剂盒的操作说明书以了解详细的水凝胶制备）。

✦ 02、研究水凝胶的机械强度对血管生成的影响
使用高浓度VitroGel AAK-HC试剂盒调节水凝胶的机械强度。将VitroGel AAK-HC水凝胶与VitroGel AAK稀释溶液分别以1:0、1:1和1:3（v/v）的比例混合。然后将稀释的水凝胶混合物与VitroGel AAK添加物混合，以根据以下方法说明制备2D水凝胶包被培养物或3D培养物（请阅读VitroGel AAK-HC试剂盒的操作说明书以了解详细的水凝胶制备）。
 

三、2D水凝胶包被培养

✦ 01、将 1 mL 水凝胶溶液加入 500 μL AAK Supplement 1 中，轻轻上下颠倒 5-10 次以充分混匀。

注意：保持VitroGel AAK溶液和AAK Supplement 1的混合比例为2：1（v / v）。

✦ 02、将 50 μL 水凝胶混合物转移到 96 孔板中。轻轻旋转孔板以确保均匀覆盖孔底部。

✦ 03、室温下静置10-15分钟以形成软凝胶。

注意：在此期间，不要摇晃孔板干扰软凝胶的形成。

✦ 04、小心地将 50 μL 细胞悬液添加到凝胶顶部。在 37°C 下孵育。

✦ 05、将细胞在37°C孵育，每隔一天更换50-80%的顶部培养基。

四、3D培养

对于HUVEC的3D培养，使用VitroGel AAK和VitroGel AAK-HC观察血管的形成和结构。使用以下步骤制备水凝胶-细胞混合物（以AAK Supplement 1为例）：

✦ 01、在AAK Supplement 1中制备细胞悬液。推荐的细胞浓度为 1-2 x10⁶细胞/mL。

✦ 02、将 1 mL 水凝胶溶液添加到上一步的 500 μL 细胞悬液中。轻轻上下颠倒 5-10 次以彻底混匀，将水凝胶和细胞悬液保持在 2：1 （v/v） 的比例。

✦ 03、将 50 μL 水凝胶混合物转移到 96 孔板中。轻轻旋转孔板以确保均匀覆盖每个孔的表面。

✦ 04、室温下静置10-15分钟以形成软凝胶。

注意：在此期间，不要摇晃孔板干扰软凝胶的形成。

✦ 05、小心地在孔顶部添加 50 μL 额外培养基以覆盖水凝胶。

✦ 06、置于37°C的培养箱中孵育，每隔一天更换50-80%的顶部培养基，以免影响培养板中的水凝胶状态（或根据实验设计更换覆盖培养基）。

五、荧光成像

 

对于荧光成像，将细胞固定并用Actin Green和NucBlue染色，以标记F-actin以及细胞核。 详细步骤如下：

 

✦ 01、用移液管小心地移除水凝胶顶部的培养基。
✦ 02、水凝胶用100 μL DPBS洗涤。将洗涤缓冲液留在水凝胶上1分钟，然后移除。
✦ 03、将100 μL细胞固定溶液（4%甲醛）加入到水凝胶表面。
✦ 04、孔板置于室温下孵育15-30分钟，然后移除固定液。
✦ 05、用 100 μL DPBS 轻轻洗涤水凝胶 3 次，使洗涤缓冲液在两次洗涤之间静置1分钟。
✦ 06、加入 100 μL 0.1% Triton X-100），并在室温下孵育 5 分钟。
✦ 07、小心地移除Triton X-100，用100 μL DPBS洗涤孔三次，使洗涤缓冲液在两次洗涤之间静置1分钟。
✦ 08、向水凝胶中加入 100 μL 封闭液（3% BSA的DPBS溶液），并在室温下孵育 60 分钟。
✦ 09、去除封闭液，添加ActinGreen 488或DRAQ5 ReadyProbes 试剂（ThermoFisher，按照操作说明添加）。
✦ 10、将孔板孵育30分钟，然后加入NucBlue Fixed Cell Stain Ready Probes试剂（ThermoFisher）。
✦ 11、孔板避光孵育5分钟并进行荧光成像。

 

六、结果和讨论
 

在水凝胶表面培养HUVEC。图1显示了接种到含有VEGF阳性AAK Supplement 2 中培养18小时的HUVEC血管生成的图像，VitroGel AAK （左图）、AAK-HC水凝胶（右图）。

图1. VitroGel AAK水凝胶顶部内皮细胞的血管生成

 

✦ 人脐静脉内皮细胞 （HUVEC） 接种在（左图）VitroGel AAK 水凝胶或（右图）VitroGel AAK-HC 水凝胶与 AAK Supplement 2中培养18小时后血管生成的图像。

✦ 荧光显微镜观察以可视化VitroGel AAK或VitroGel AAK-HC水凝胶上的HUVEC活性和血管生成。图2显示了肌动蛋白丝的免疫荧光图像和HUVEC的核酸染色。在这里，我们观察到大量的肌动蛋白丝和核酸，表明水凝胶的巨大活力以及整体血管的形成和形态。

图2. HUVEC细胞在VitroGel AAK水凝胶（A）/VitroGel AAK-HC水凝胶（B）与AAK Supplement 2上的管状形态。将细胞固定并用DAPI（蓝色）和actin green（绿色）染色。

 

✦ 当使用VEGF阴性添加物（VitroGel AAK Supplement 1）的水凝胶时，在VitroGel AAK和VitroGel AAK-HC水凝胶的两种情况下，HUVEC能够在表面上附着和生长而不会形成管（图3）。图2和图3表明，尽管在两种水凝胶条件下使用了相同的完全培养基，但水凝胶中的VEGF生长因子会显着影响管的形成。
 

图3.HUVEC细胞在VitroGel AAK水凝胶（A）/VitroGel AAK-HC水凝胶（B）与AAK Supplement 1上的生长形态。将细胞固定并用DRAQ5（红色）和actin green（绿色）染色。

 

✦ 接下来，我们旨在比较在补充或不补充生长因子的情况下制备的VitroGel AAK水凝胶上的HUVEC生长，以突出生长因子对水凝胶血管生成的影响。在该实验中，在水凝胶顶部使用相同的完整内皮生长培养基进行细胞培养。在图4的不同时间点获得具有VitroGel AAK Supplement 2或不含生长因子的水凝胶顶部的HUVEC细胞生长。图4B和4D显示了在水凝胶表面上生长的细胞，其中不含生长因子添加物，而图4A和4C显示了给予VitroGel AAK-Supplement 2的细胞的图像。

有趣的是，尽管在两种培养条件下都使用了完整的细胞培养基，但与未从水凝胶中补充生长因子的细胞相比，延时视频显示，添加细胞生长因子后，水凝胶中的细胞附着和血管生成有显着改善。

这些图像为水凝胶添加物对HUVEC增殖和活力的益处提供了进一步的证据，因为与接受水凝胶生长因子支持的细胞相比，没有补充生长因子的细胞清楚地显示出更少的管腔结构（图4D红色箭头）。

图4.有和没有生长因子添加物的VitroGel AAK水凝胶顶部内皮细胞生长的比较。左上）实时视频显示HUVEC接种在含有VEGF的AAK Supplement 2中培养18小时的血管生成图；右上）实时视频显示没有细胞生长因子的HUVEC接种；C）HUVEC细胞在不同时间点在具有AAK Supplement 2的VitroGel AAK水凝胶顶部生长；D）没有细胞生长因子的不同时间点的HUVEC细胞生长。红色箭头表示管状结构形成。

 

✦ 对于VitroGel AAK-HC水凝胶的研究，我们旨在提供基质的机械性能如何影响HUVEC血管生成的新方案。因此，我们制备了不同浓度的水凝胶，以实现水凝胶基体的各种机械强度。VitroGel AAK Supplement 2用于制备所有水凝胶，以消除生长因子对细胞生长的影响，以专注于机械性能的影响。这些分析的结果如图5所示。
更强的水凝胶机械强度（即较低的稀释比，例如1:0）导致血管生成减少，因为细胞更容易聚集导致细胞死亡。与较软的水凝胶混合物（如 1:1 稀释或 1:3 稀释）相比，1:0 稀释比例的管结构形成明显减少。特别是，在血管生成后，1:0稀释水凝胶表面上的细胞在大约12小时的时间点开始聚集并形成细胞球状体。在16:1稀释的1小时时间点观察到类似的观察结果，而对于最柔软的水凝胶（1:3稀释），细胞能够附着在水凝胶表面并在18小时逐渐形成管结构。
水凝胶的理想情况应该是它帮助细胞适应特定物质的能力，并最终使细胞能够很好地扩散并附着在基质上，最终诱导血管生成。总体而言，这些数据表明高机械强度对于管结构的形成和血管生成特性并不是最佳的。同样，这些数据表明，较软的水凝胶浓度在较长时间内为细胞附着和活力提供了更好的支持。

图5 水凝胶机械强度对血管生成的影响
 

结

语

应用中描述的数据为无异源水凝胶血管生成试剂盒 VitroGel Angiogenesis Assay Kits 作为HUVEC 细胞 2D 水凝胶包被和 3D 培养研究工具的实用性提供了证据。

这些数据表明，水凝胶中的生长因子（例如VEGF）会显著影响血管的形成。同样，水凝胶浓度本身对于生长，增殖和血管生成也很重要，因为具有较高机械强度的水凝胶导致血管生成大大减少，而较软的水凝胶促进这种生长。

总之，水凝胶血管生成试剂盒 VitroGel Angiogenesis Assay Kits  可以精确地模拟体内内皮细胞微环境，血管生成的细胞-细胞间和细胞-环境间的相互作用。我们希望这些工具可以助力研究人员探索血管生成过程的更全面的机制，以及建立组织模型，用于药物筛选、细胞侵袭和癌症研究等应用。
 

 

参考文献

 

1、Amann, A., Zwierzina, M., et al (2017) Development of a 3D angiogenesis model to study tumour – endothelial cell interactions and the effects of anti-angiogenic drugs. Scientific Reports, 7(1).
2、Jacobs, K. A., & Gavard, J., (2018) 3D Endothelial Cell Migration. Methods in Molecular Biology , 1749, 51–58.
3、Stepanova, D., Byrne, H. M.,et al. (2021). A multiscale model of complex endothelial cell dynamics in early angiogenesis. PLOS Computational Biology, 17(1), e1008055.
4、Rajendran, P., Rengarajan, T., Thangavel, J., et al. I. (2013). The Vascular Endothelium and Human Diseases. International Journal of Biological Sciences, 9(10), 1057–1069.

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