高通量测序后的下游实验验证方法之m6A RNA甲基化篇
此前，我们分享了m6A RNA甲基化研究的数据挖掘思路，进而筛选出m6A修饰目标基因。
做完MeRIP-seq测序后，如果需要对分析结果中感兴趣的内容进行后期验证，则需要进行下游实验设计。m6A RNA甲基化修饰目标基因的进一步验证或后期试验包括以下6个方面：
（1）简单验证
A. 目标基因m6A甲基化的验证：MeRIP-RT-PCR
B. 检测目标基因的mRNA表达水平：RT-qPCR
C. 检测目标基因蛋白质表达水平：Western blot
（2）全局m6A甲基化干扰实验（非靶向），验证m6A甲基化书否真的影响目标基因表达和细胞功能
A. m6A甲基化干扰：m6A writers/erasers的突变/敲降/敲除/过表达、m6A甲基化抑制剂
如环亮氨酸、m6A去甲基化抑制剂如FTO抑制剂FB23-2
B. 检测m6A甲基化整体变化：m6A甲基化免疫荧光染色（定性）、m6A斑点杂交（定性）、比色法（定量）、质谱法（定量）
C. 检测目标基因的m6A甲基化变化：MeRIP-qPCR
D. 检测目标基因的mRNA水平：RT-qPCR
E. 检测目标基因蛋白质水平：Western blot
F. 检测细胞功能/表型变化
（3）靶向目标基因的甲基化/去甲基化实验，检测某区域m6A修饰是否真的影响目标基因的表达
A. 目的基因m6A甲基化干扰细胞系的构建：荧光素酶活性分析实验（Luciferase activity assay）——构建含甲基化/未甲基化m6A位点的目标基因-荧光素酶表达质粒，转染细胞并表达。
B. 检测目标基因的m6A甲基化变化：MeRIP-qPCR
C. 检测荧光素酶报告基因的mRNA表达水平：RT-qPCR
D. 检测目标基因蛋白质表达水平：Western blot
E. 检测细胞功能受到的影响：免疫荧光显微观察、功能标志物测定... ...
用于验证目标基因上m6A甲基化功能的双荧光素酶报告系统
（4）研究目标基因的m6A甲基化如何影响目标基因表达
A. 检测m6A是否通过影响目标基因翻译而影响蛋白质水平：
Polysome profiling
Ribo-seq
通过对结合核糖体上的mRNA进行定量，分析目标基因的蛋白翻译效率
Polysome Profiling方法举例：
siMETTL3/14对目标基因与与核糖体的结合造成影响，对内参基因GAPDH无影响。
B. 研究m6A是否通过调节mRNA的稳定性和降解而影响目标基因蛋白水平
研究m6A对目标基因mRNA水平的影响
RT-qPCR
RNA-seq
METTL3/14干扰后，采用RT-PCR和RNA-seq检测目标基因的mRNA水平是否收到影响
C. 研究m6A是否通过调控RNA的出核（nuclear export）而影响目标基因蛋白水平
裂解细胞，超速离心分离细胞核与细胞质，然后分别进行RT-PCR实验检测细胞核与细胞质中的mRNA水平
METTL3/14干扰后，采用RT-PCR检测目标基因在细胞核与细胞质中的mRNA水平是否受到影响
（5）m6A修饰目标基因的表达回复实验
A. writers的突变/敲降/敲除实验：
RT-PCR检测目标基因的mRNA水平变化
Western blot检测目标基因的蛋白水平变化
检测目标基因的功能
B. writers的突变/敲降/敲除后，目标基因的过表达回复实验：
检测各项表型指数、细胞增殖、分化的回复情况
METTL3敲除后，靶基因Ezh2的蛋白表达受到影响。而靶基因Ezh2过表达回复实验会消除METTL3敲除对细胞增殖分化的不利影响
（6）研究特定m6A Readers通过结合目标基因RNA而影响目标基因的蛋白表达
YTHDF1引入突变后，检测其假定靶基因的表达和与靶基因的结合是否受到影响
做完MeRIP-seq测序后，如果需要对分析结果中感兴趣的内容进行后期验证，则需要进行下游实验设计。m6A RNA甲基化修饰目标基因的进一步验证或后期试验包括以下6个方面：
- 简单验证
- 全局m6A甲基化干扰实验（非靶向），验证m6A甲基化书否真的影响目标基因表达和细胞功能
- 靶向目标基因的甲基化/去甲基化实验，检测某区域m6A修饰是否真的影响目标基因的表达
- 研究目标基因的m6A甲基化如何影响目标基因表达
- m6A修饰目标基因的表达回复实验
- 研究特定m6A Readers通过结合目标基因RNA而影响目标基因的蛋白表达
（1）简单验证
A. 目标基因m6A甲基化的验证：MeRIP-RT-PCR
B. 检测目标基因的mRNA表达水平：RT-qPCR
C. 检测目标基因蛋白质表达水平：Western blot
（2）全局m6A甲基化干扰实验（非靶向），验证m6A甲基化书否真的影响目标基因表达和细胞功能
A. m6A甲基化干扰：m6A writers/erasers的突变/敲降/敲除/过表达、m6A甲基化抑制剂
如环亮氨酸、m6A去甲基化抑制剂如FTO抑制剂FB23-2
B. 检测m6A甲基化整体变化：m6A甲基化免疫荧光染色（定性）、m6A斑点杂交（定性）、比色法（定量）、质谱法（定量）
C. 检测目标基因的m6A甲基化变化：MeRIP-qPCR
D. 检测目标基因的mRNA水平：RT-qPCR
E. 检测目标基因蛋白质水平：Western blot
F. 检测细胞功能/表型变化
FB23-2给药后，大脑损伤组神经功能缺陷评分显著变差
（3）靶向目标基因的甲基化/去甲基化实验，检测某区域m6A修饰是否真的影响目标基因的表达
A. 目的基因m6A甲基化干扰细胞系的构建：荧光素酶活性分析实验（Luciferase activity assay）——构建含甲基化/未甲基化m6A位点的目标基因-荧光素酶表达质粒，转染细胞并表达。
B. 检测目标基因的m6A甲基化变化：MeRIP-qPCR
C. 检测荧光素酶报告基因的mRNA表达水平：RT-qPCR
D. 检测目标基因蛋白质表达水平：Western blot
E. 检测细胞功能受到的影响：免疫荧光显微观察、功能标志物测定... ...
用于验证目标基因上m6A甲基化功能的双荧光素酶报告系统
（4）研究目标基因的m6A甲基化如何影响目标基因表达
A. 检测m6A是否通过影响目标基因翻译而影响蛋白质水平：
Polysome profiling
Ribo-seq
通过对结合核糖体上的mRNA进行定量，分析目标基因的蛋白翻译效率
通过对结合核糖体上的mRNA进行定量，分析目标基因的蛋白翻译效率
Polysome Profiling方法举例：
siMETTL3/14对目标基因与与核糖体的结合造成影响，对内参基因GAPDH无影响。
B. 研究m6A是否通过调节mRNA的稳定性和降解而影响目标基因蛋白水平
研究m6A对目标基因mRNA水平的影响
RT-qPCR
RNA-seq
C. 研究m6A是否通过调控RNA的出核（nuclear export）而影响目标基因蛋白水平
裂解细胞，超速离心分离细胞核与细胞质，然后分别进行RT-PCR实验检测细胞核与细胞质中的mRNA水平
METTL3/14干扰后，采用RT-PCR检测目标基因在细胞核与细胞质中的mRNA水平是否受到影响（5）m6A修饰目标基因的表达回复实验
A. writers的突变/敲降/敲除实验：
RT-PCR检测目标基因的mRNA水平变化
Western blot检测目标基因的蛋白水平变化
检测目标基因的功能
B. writers的突变/敲降/敲除后，目标基因的过表达回复实验：
检测各项表型指数、细胞增殖、分化的回复情况
METTL3敲除后，靶基因Ezh2的蛋白表达受到影响。而靶基因Ezh2过表达回复实验会消除METTL3敲除对细胞增殖分化的不利影响
（6）研究特定m6A Readers通过结合目标基因RNA而影响目标基因的蛋白表达
- 合理推测结合目标基因的m6A Readers是哪一种
- Readers的突变/敲降/敲除/过表达实验：
- 验证靶基因的mRNA水平
- 的RIP-qPCR验证Readers蛋白与靶基因mRNA的结合
YTHDF1引入突变后，检测其假定靶基因的表达和与靶基因的结合是否受到影响
