CAR-T细胞治疗技术之CAR分子构建与慢病毒包装的常见问题与解答

CAR-T细胞疗法是一种新兴的肿瘤免疫治疗方法，对比传统的手术方法具有着自身不可替代的优势和发展潜力。在CAR-T技术的实施中，CAR分子构建和慢病毒包装是非常重要的。尽管近些年来，CAR分子设计和细胞功能的改进有了明显提高，慢病毒载体的研究也有了很大进展，但距离在临床上稳定应用还有很长的路要走。

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Q1：设计CAR分子时候对如何筛选合适的抗体scFv序列？
Answer
选择用于构建CAR-T细胞的抗体有两个很重要的指标：抗体的特异性和亲和力。特异性决定了所构建CAR-T细胞用于治疗的安全性，亲和力决定了CAR-T细胞的功能。CAR-T细胞构建对所用抗体的亲和力要求并不是越高越好，这一点上不同于抗体药物，而是要有个适当的范围，所以这一点就需要大量的实验来筛选出亲和力适当的抗体scFv序列。

Q2：CAR-T、CAR-NK以及CAR-Macrophage中使用的CAR分子结构上是否有差异？
Answer
用于构建CAR-T的CAR分子一般情况下也适合于构建CAR-NK和CAR-M。但是，目前也有不少针对于NK细胞设计的CAR分子，其主要在共刺激信号分子的使用上不同于CAR-T细胞的CAR分子，例如其使用DAP10和DAP12作为共刺激信号；对于巨噬细胞的CAR分子，其结构中不需要包含共刺激分子只含有CD3ζ信号分子，由于CD3ζ和巨噬细胞Fc受体信号分子的相似性，因此含CD3ζ信号分子的CAR-巨噬细胞也能有效的进行特异性的吞噬作用。

Q3：不引入标签的情况下，如何实现CAR-T细胞阳性率的检测？
Answer
目前市面上有应该标记的靶蛋白，可以通过这些靶蛋白标记CAR-T细胞结合流式法来实现CAR-T细胞阳性率的检测；另外，如果有针对CAR蛋白scFv的抗抗体，也可以使用抗抗体来检测。

Q4：CAR慢病毒的滴度需要达到多少才能用于CAR-T细胞构建，除滴度这一指标外，慢病毒还进行哪些指标的检测？
Answer
一般要求活性滴度要大于1×10^8Tu/ml，除滴度这一指标外，一般会进行无菌、支原体以及内毒素等常规检测。

Q5：我们构建的CAR-T细胞阳性率总是过低应该如何解决？
Answer
一方面可以提高慢病毒的质量，例如滴度纯度等；另一方面，可以通过优化转染条件等；再一方面可以通过优化CAR分子的结构，因为CAR分子的结构以及其稳定性都是影响CAR-T细胞阳性率的重要因素。