顺乌头酸酶（ACO）活性检测试剂盒使用说明书

 
注    意：正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义：
顺乌头酸酶（aconitase），三羧酸循环中的酶，催化柠檬酸转变为异柠檬酸。柠檬酸本身不易氧化，在顺乌头酸酶作用下，通过脱水与加水反应，使羟基由β碳原子转移到α碳原子上，生成易于脱氢氧化的异柠檬酸，为进一步的氧化脱羧反应作准备。
 
测定原理：ACO催化柠檬酸转化成异柠檬酸，异柠檬酸氧化脱羧将NAD⁺ 还原生成NADH，导致340nm处光吸收上升。
需自备的仪器和用品：紫外分光光度计、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1mL石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水。
 
试剂的组成和配制：
试剂一：50mL×1瓶，-20℃保存；
试剂二：10mL×1瓶，-20℃保存；
试剂三：1mL×1支，-20℃保存；
试剂四：液体60mL×1瓶，4℃保存；
试剂五：液体5mL×1瓶，4℃保存；
试剂六：粉剂×1支，-20℃保存；临用前加3mL蒸馏水充分溶解；现配现用
试剂七：粉剂×1支，4°保存；临用前加36mL试剂四充分溶解；
工作液：临用前在36mL试剂七中加入3mL蒸馏水、3mL试剂四、3mL试剂五、3mL试剂六充分混匀
 
样本的前处理：
组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离：
1、 称取约0.1g组织或收集500万细胞，加入1mL试剂一和10uL 试剂三，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。
2、 将匀浆转入离心管内600g，4℃离心5min。
3、 弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，11000g，4℃离心10min。
4、 上清液即胞浆提取物，可用于测定胞质顺乌头酸酶活性。
5、 在步骤④的沉淀中加入200uL试剂二和2uL 试剂三，超声波破碎（冰浴，功率20％或200W，超声3秒，间隔10秒，重复30次），用于线粒体顺乌头酸酶活性测定。
 
测定步骤：

• 分光光度计预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。
• 样本测定

（1）将工作液，置于37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）水浴10min；现配现用；若分次用将工作液分装后于-20°保存，一星期内可用。
（2）在1mL石英比色皿中加入100μL样本900μL工作液，混匀，立即记录340nm处20s时的吸光值A1和 3min20s后的吸光值A2，计算ΔA=A2-A1。
 
ACO活性计算：
用石英比色皿测定的计算公式如下
（1） 按样本蛋白浓度计算
单位的定义：每mg组织蛋白每分钟生成1 nmol的NADH定义为一个酶活性单位。
 ACO活性（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×10⁹]÷(Cpr×V样) ÷T=536×ΔA÷Cpr
（2） 按样本鲜重计算
单位的定义：每g组织每分钟生成1 nmol的NADH定义为一个酶活性单位。
ACO（nmol/min/g 鲜重）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×10⁹]÷(W ×V样÷V样总) ÷T=108×ΔA÷W
（3） 按细菌或细胞密度计算
单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟生成1 nmol的NADH定义为一个酶活性单位。
ACO活性（nmol/min/10⁴ cell）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×10⁹]÷(500×V样÷V样总)÷T=0.722×ΔA
V反总：反应体系总体积，0.001 L；ε：NADH摩尔消光系数，6.22×10³ L / mol /cm；d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.1 mL；V样总：加入提取液体积，0.202 mL；T：反应时间，3min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500万。