糖原合成酶（Glycogen synthase，GCS）试剂盒使用说明书

 
注    意：正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定
测定意义：
GCS（EC 2.4.1.11）催化UDPG和葡萄糖残基生成糖原和UTP，以α-1，4-糖苷键相连延长糖链，是肝和肌肉糖原合成酶的限速酶，是胰岛素作用的主要靶酶，对糖代谢的调节和血糖稳态的维持具有重要作用。
 
测定原理：
GCS催化UDPG和葡萄糖残基生成糖原和UDP，丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶进一步依次催化NADH氧化生成NAD⁺，在340nm下测定NADH下降速率，即可反映GCS活性。
 
需自备的仪器和用品：
紫外分光光度计、台式离心机、可调式移液器、1 mL石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水。
 
试剂的组成和配制：
提取液：60mL×1瓶，4℃保存；
试剂一：液体45 mL×1瓶， 4℃保存； 
试剂二：液体5mL×1瓶，4℃保存；
试剂三：液体41μL×1支，4℃保存；
试剂四：粉剂×1支， -20℃保存；
试剂五：粉剂×1瓶， -20℃保存；
 
样本的前处理： 
按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。
 
测定步骤：

• 分光光度计预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。
• 工作液的配制：临用前将试剂三和试剂四转移到试剂一中混合溶解待用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。
• 试剂五的配制：临用前在试剂五瓶中加入2.5mL试剂二充分溶解待用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。
• 将工作液和试剂五置于37℃预热5分钟。
• 在1mL石英比色皿中加入50μL样本、50μL试剂五和900μL工作液，立即混匀，记录340nm处初始吸光值A1和1min后的吸光值A2，计算ΔA=A1-A2。

 
注意：在该试剂盒中，若ΔA大于0.1，需将样本用提取液稀释适当倍数后测定，使ΔA小于0.1可提高检测灵敏度。计算公式中乘以相应稀释倍数。
 
GCS活性计算：
（1）按样本蛋白浓度计算
单位定义：每mg组织蛋白每分钟消耗1nmol NADH定义为一个酶活力单位。
GCS（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×10⁹]÷(V样×Cpr) ÷T=3215×ΔA÷Cpr
（2）按样本鲜重计算
单位定义：每g组织每分钟消耗1 nmol NADH定义为一个酶活力单位。
GCS（nmol/min/g 鲜重）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×10⁹]÷(W ×V样÷V样总)÷T=3215×ΔA÷W
V反总：反应体系总体积，1×10^-3 L；ε：NADH摩尔消光系数，6.22×10³ L / mol /cm；d：比色皿光径，1cm；V样：加入样本体积，0.05 mL；V样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，1 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g。