在血清样品中通过化学发光免疫实验检测新冠 IgG 抗体
简介
作为新冠病毒免疫反应的一部分，感染者体内会产生病毒特异性抗体，在出现症状后的一至三周内，这些抗体可以在血液中被检测到。IgG 和 IgM 几乎同时出现，而 IgG 在更长时间内维持一个高水平。在血清中，由于感染病毒或接种疫苗而产生的可检测到的抗体可以防范将来被新冠病毒感染。但这些抗体持续的时间长短和提供保护的程度是有关新冠病毒仍需密切调查的众多问题之一。
在人体血清中，通过免疫实验来检测新冠抗体是增进我们了解这种疾病以及疫苗研究的重要工具。Promega LumitTMDx SARS-CoV-2 免 疫 实 验 使 用了 带 有 SmBiT 和 LgBiT ( 这是 NanoLuc 荧光素酶的两个亚基，只有当它们通过结合相互靠近时，才具有功能 ) 标记的新冠病毒刺突蛋白受体结合区域(RBD) 的一个片段。当这些标记过的病毒蛋白片段与含有新冠病毒抗体的样品一起孵育时，他们将与抗体结合，将 SmBiT和 LgBiT 两个亚基结合到一起，并产生功能性的荧光素酶。添加 Lumit 检测试剂，在微孔板光度计上测量产生的荧光信号。
Lumit 实验中，样品的添加和测读如图 1 所示。没有清洗的步骤并且一小时内测得结果，使得这个实验可以应用于高通量筛选。SpectraMax iD5 多功能酶标仪具有超冷光电倍增管(PMT)，可以为 Lumit Dx 新冠病毒免疫实验提供高灵敏度的发光检测。
优点
•放大高通量筛选，省去清洗步骤，
•样品体积仅需 15 微升，
•样品体积仅需 15 微升，
• 一小时内测得结果。
图 1 Lumit Dx 新冠病毒免疫实验的工作流程。添加 - 孵育 - 测读全流程将在一小时内完成，并且可以用于自动化和高通量筛选。
材料
材料
• Lumit Dx 新冠病毒免疫实验试剂盒 (Promega cat. #VB1080)
• 新冠病毒阳性血清样品 (BioIVT cat. #HMSRM-COVID)
• 正常人血清 (Amsbio cat. #HSER-2mL)
• 白色 96 孔板 (Greiner cat. #655075)
• SpectraMax iD5 多功能酶标仪 ( 美谷分子仪器 )
方法
实验试剂的准备和微孔板的操作如下 ( 更多的细节， 请参阅Lumit Dx 新冠病毒免疫实验技术手册)：
方法
实验试剂的准备和微孔板的操作如下 ( 更多的细节， 请参阅Lumit Dx 新冠病毒免疫实验技术手册)：
1.
制备 1x Lumit-Dx 免 疫 实 验 稀 释 缓 冲 液 ( 添 加 5mL 10xLumit-Dx 免 疫 实 验 稀 释 缓 冲 液 至 45 mL Lumit-Dx PBS/EGTA 溶液中 )。
制备 1x Lumit-Dx 免 疫 实 验 稀 释 缓 冲 液 ( 添 加 5mL 10xLumit-Dx 免 疫 实 验 稀 释 缓 冲 液 至 45 mL Lumit-Dx PBS/EGTA 溶液中 )。
2.
来源于新冠患者或健康受试者的30 uL 血清样本， 与 70 uL1x Lumit-Dx 免疫实验稀释缓冲液混合。 有足够的体积进行三次实验； 通常每个孔仅需 15 uL 样品。
来源于新冠患者或健康受试者的30 uL 血清样本， 与 70 uL1x Lumit-Dx 免疫实验稀释缓冲液混合。 有足够的体积进行三次实验； 通常每个孔仅需 15 uL 样品。
3.
Lumit-Dx CoV-2 BiTs Master Mix 现 配 现 用， 配 方 如 下：5mL 1x Lumit-Dx 免疫实验稀释缓冲液、9.4 uL Lumit-DxCoV-2 LgBiT( 红色盖子 )、9.4 uL Lumit-Dx CoV-2 SmBiT( 蓝色盖子 )。 添加完毕后， 轻微地颠倒混匀。
Lumit-Dx CoV-2 BiTs Master Mix 现 配 现 用， 配 方 如 下：5mL 1x Lumit-Dx 免疫实验稀释缓冲液、9.4 uL Lumit-DxCoV-2 LgBiT( 红色盖子 )、9.4 uL Lumit-Dx CoV-2 SmBiT( 蓝色盖子 )。 添加完毕后， 轻微地颠倒混匀。
4.
Lumit-Dx 阳性对照、Lumit-Dx 阴性对照、Lumit-Dx 实验校准试剂， 解冻后放置于室温及时使用。 简短的离心可使管壁内容物甩至管底。
结果
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Lumit-Dx 阳性对照、Lumit-Dx 阴性对照、Lumit-Dx 实验校准试剂， 解冻后放置于室温及时使用。 简短的离心可使管壁内容物甩至管底。
5.
按如下操作， 添加试剂至白色 96 孔板中：
按如下操作， 添加试剂至白色 96 孔板中：
• 每个孔加入 40uL Lumit CoV-2 BiTs Master Mix，
• 20uL 稀释的病人血清样本， 三个重复，
• 20uL Lumit-Dx 阳性对照， 三个重复，
• 20uL Lumit-Dx 阴性对照， 三个重复，
• 20uL Lumit-Dx 实验校准试剂， 三个重复，
6.
将微孔板封盖， 室温孵育 20 分钟。
将微孔板封盖， 室温孵育 20 分钟。
7.
孵育后， 制备 Lumit-Dx 检测试剂 (7mL 1x Lumit-Dx 免疫实验稀释缓冲液、230 uL Lumit-Dx 检测底物 ( 灰色盖子 )，现配现用。 轻微地颠倒混匀。
孵育后， 制备 Lumit-Dx 检测试剂 (7mL 1x Lumit-Dx 免疫实验稀释缓冲液、230 uL Lumit-Dx 检测底物 ( 灰色盖子 )，现配现用。 轻微地颠倒混匀。
8.
60 uL 检测试剂加入孔中， 室温孵育 3 分钟。
60 uL 检测试剂加入孔中， 室温孵育 3 分钟。
9.
使用 SpectraMax iD5 读板机测读， 如表 1 所设置。 测读完成后， 相对发光单位 (RLUs) 显示在 SoftMax Pro 软件的plate 板块中。 在模板中， 这些孔被分配到不同的组中，各组产生的表单被用于计算和显示数据结果。
实验的质控按照试剂盒技术手册进行评估。 Lumit-Dx 实验校准试剂、Lumit-Dx 阳性对照、Lumit-Dx 阴性对照都被用于确保最合适的实验性能。 相比于 Lumit-Dx 实验校准试剂， 阳性对照必须产生更高的相对发光单位值， 阴性对照必须产生更低的相对发光单位值。 如果这些条件不满足， 微孔板测读结果将是无效的。
使用 SpectraMax iD5 读板机测读， 如表 1 所设置。 测读完成后， 相对发光单位 (RLUs) 显示在 SoftMax Pro 软件的plate 板块中。 在模板中， 这些孔被分配到不同的组中，各组产生的表单被用于计算和显示数据结果。
实验的质控按照试剂盒技术手册进行评估。 Lumit-Dx 实验校准试剂、Lumit-Dx 阳性对照、Lumit-Dx 阴性对照都被用于确保最合适的实验性能。 相比于 Lumit-Dx 实验校准试剂， 阳性对照必须产生更高的相对发光单位值， 阴性对照必须产生更低的相对发光单位值。 如果这些条件不满足， 微孔板测读结果将是无效的。
表 1 Lumit-Dx 实验中，SpectraMax iD5 读板机仪器参数设置。全波长 ( 无波长选项 ) 设置被用于最大化的发光检测。读板高度在 SoftMaxPro 软件中的读板高度调整设置之前进行了优化。
结果
实验结果通过每一个测试样品 (S) 的相对发光单位 (RLU) 与实验校准试剂 (C) 的平均相对发光单位的比值计算得到。 S/C 比值≥ 1， 样品中新冠抗体为阳性；S/C 比值＜ 1， 样品中新冠抗体为阴性。 实验校准试剂的平均相对发光单位是 548， 六位新冠患者样本的平均相对发光单位从 1787 至 14155 不等， 健康受试者的相对发光单位是 86。
如表 2 显示， 新冠患者样本的比值都是大于 1， 显示阳性结果， 而健康受试者的比值都是小于 1， 显示阴性结果。
备注： 此实验样品板也在 SpectraMax i3X, SpectraMax M5,SpectraMax L 酶标仪上测读， 获得相似的结果。
表 2 在 SpectraMax iD5 读板机上获得的 Lumit Dx 新冠病毒实验检测结果。所有的样品和实验对照都有三次重复，并计算出变异系数 CV值。运用 SoftMax Pro 软件计算并分析实验结果。
结论
研究人员通过检测大量的新冠病毒感染患者和已接种疫苗的人的血清样本， 进一步了解免疫反应发生和持续的时间， 因此，大量的血清样本新冠抗体的快速检测变得尤为迫切。 Lumit Dx新冠病毒免疫实验为科学家提供了一个简化的流程， 可以更快速地获得结果。 联合使用 SpectraMax iD5 读板机和 SoftMaxPro 软件， 实验数据的计算和分析更加自动化， 减少手动操作时间， 可以有更高的通量。
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参考文献
1. Post N, Eddy D, Huntley C et al. Antibody response to
SARS-CoV-2 infection in humans: A systematic review. PLoS
ONE 15(12):e0244126 (2020)
2. Long QX, Liu BZ, Deng HJ et al. Antibody responses to
SARS-CoV-2 in patients with COVID-19. Nat Med 26, 845–848
(2020).
